Wolfgang Willenbacher
Dr.med.
HERSTELLUNG UND CHARAKTERISIERUNG MONOKLONALER
ANTIKÖRPER GEGEN HERPES SIMPLEX VIRUS TYP-1 STRUKTURPROTEINE
Geboren am 29.06.1962 in Karlsruhe
Reifeprüfung am 18.05.1982 in Karlsruhe
Studiengang der Fachrichtung Medizin vom WS 1985/86 bis WS 1992/93
Physikum am 25.08.1987 an der Universität Heidelberg
Klinisches Studium an der Universität Heidelberg
Praktisches Jahr an der Universitätsfrauenklinik, der chirurgischen Universitätsklinik und der
Med. Poliklinik Abt. Innere V der Universitätsklinik Heidelberg
Staatsexamen am 25.03.1993 an der Universität Heidelberg
Promotionsfach: Hygiene
Doktorvater: Prof. Dr. med. habil. R.W. Braun
Im Rahmen der vorgestellten Dissertationsarbeit : Herstellung und Charakterisierung
monoklonaler Antikörper gegen Herpes Simplex Virus Typ 1 wurden 29 monoklonale
Antikörper mit Spezifität für HSV-1 Strukturproteine etabliert. Die isolierten m’Ak wurden
einer breit gefächerten Charakterisierung in virologischen, immunologischen,
proteinbiochemischen, molekularbiologischen und funktionellen Testsystemen unterworfen.
So wurden: Immunglobulinsubtyp und Leichtkettenstatus, die Kreuzreaktivität mit anderen
Herpesviridae, die Virustypspezifität, die Virusstammspezifität, die Reaktivität mit nicht N-
glykosylierten Tunicamycin behandelten Virionen, die Reaktivität mit zellulären Proteinen,
die Zuordnung zu den HSV-Proteinen (Antigencharakterisierung), die Virus-neutralisierende
Aktivität (NT), und die Tauglichkeit der Antikörper in Western-Blot-Analyse (WBA),
RIPA-PAGE, Immunfluoreszenztest (IFT) und Affinitätschromatographie (AC) systematisch
untersucht.
Bei den m'Ak dominierten IgG-1 (19/29) kappa (25/29) Isolate. Bei den erkannten Antigenen
dominierten die viralen Glykoproteine gC (13), gD (6) und gB (2). Des weiteren wurde ein
m’Ak gegen ein Capsidprotein (VP 5), ein m’Ak gegen p40 und 6 m’Ak ungeklärter
Spezifität isoliert. Es fanden sich keine Kreuzreaktivitäten der m’Ak mit Proteinen anderer
Herpesviridae oder Zellproteinen. 20 m’Ak erwiesen sich als HSV-1 typspezifisch, 9 zeigten
subtypübergreifende Reaktivität mit HSV-2. Für die m’ Ak IV.3 und IV.4 konnte die
Abhängigkeit der gD-Reaktivität von der Tunicamycin abhängigen N-Glykosylierung
gezeigt werden. 20/29 m’Ak waren reaktiv im ELISA, 22/29 im WBA, 10/29 im RIPA, 5/29
im NT, 15/29 im IFT und 4/5 der untersuchten in der AC. Reaktivität in RIPA und WBA
einerseits, sowie virus-neutralisierende Aktivität und Immunfluoreszenzreaktivität waren
regelhaft vergesellschaftet, was auf die jeweils änhlichen Proteinkonformationen in diesen
Tests (lineare Peptid-backbone Epitope vs. Konformationsepitope) zurückzuführen ist.
Mit Hilfe von Kompetitionsexperimenten konnten 2 Kompetitionsgruppen von m’Ak gegen
gD (Klone: IV.3;4 vs. IV.12) und 4 von m’Ak gegen gC (Klone: IV.1;6;7 vs. IV.2 vs. IV.8
vs. IV.13;19) definiert werden. Ein feineres Epitopmapping gelang mit Hilfe der Analyse der
Reaktivität mit HSV-1-Glykoprotein-ß-Gal-Fusionsproteinen für 5 m’Ak. So konnte das
Epitop von m’Ak IV.9 auf die Aminosäuren 1-81 von gC eingegrenzt werden, die beiden
Epitope der m’Ak IV.7-11-13 auf die Aminosäuren 453-523 von gC und das Epitop von
m’Ak IV.27 auf die Aminosäurepositionen 49-505 von gB.
Die Steuerung der Isolierung von m'Ak gewünschter Spezifitäten und Eigenschaften gelang
über einen Screening-gesteuerten Ansatz mit höherer Effizienz, als über einen
Immunisierungs-gesteuerten. Die Isolierung von m'Ak gegen die Glykoproteine gC und gD
gelang bereits mit unspezifischem Screening (ELISA, Dot-Blot), während die Etablierung
von Klonen mit anderen Spezifitäten (gB) ein gezieltes Suchprogramm (Mini-WBA )
erforderte. Zumindest für hochimmunogene Antigene (wie virale Glykoproteine) ist somit
nach unseren Erfahrungen die Isolierung von m'Ak screeninggesteuert mit geringerem
Aufwand und höherer Ausbeute möglich, als immunisierungsgesteuert. Die Manipulation
gewünschter Eigenschaften von m’Ak erwies sich ebenfalls, als einer Screening Steuerung
gut zugänglich. Monoklonale Antikörper mit zugeordneten lineraren Epitopen ließen sich
über Testsysteme mit denaturiertem Antigen (Western-Blot; ELISA), solche mit putativen
Konformationsepitopen über Neutralisationteste und Immunfluoreszenzteste erfassen. Die
Reagibilität von m’Ak mit beta-Gal-HSV-Fusionsproteinen war hochgradig (4/5 reagiblen
m’Ak) mit der Zuordnung zu Konformationsepitopen korreliert.
Mit Hilfe der solchermaßen charakterisierten m’Ak konnten HSV-1 und HSV-2
typspezifische bzw. nicht-typspezifische Kontrollproben für WBA und IFT
zusammengestellt werden sowie virale Glykoproteine in Reinform dargestellt werden (AC).
Hierdurch war eine Bestimmung der viralen Glykoproteine (gC, gB, gD) möglich, die an
frühen Anheftungsprozessen des HSV an die Zellmembran in non-kooperativer Weise
beteiligt sind (Kühn, et al. 1995; J. Virol . 64: 2491-2497 1990).
