Identifizierung von Faktoren, die funktionell mit dem
Sac1p Protein in Saccharomyces cerevisiae interagieren
INAUGURAL-DISSERTATION
zur
Erlangung der Doktorwürde
der
Naturwissenschaftlich-Mathematischen Gesamtfakultät
der
Ruprecht – Karls – Universität
Heidelberg
vorgelegt von
Diplom-Chemikerin Angela Then
aus
Rheinfelden (Baden)
Heidelberg, im November 1999
INAUGURAL-DISSERTATION
zur
Erlangung der Doktorwürde
der
Naturwissenschaftlich-Mathematischen Gesamtfakultät
der
Ruprecht – Karls – Universität
Heidelberg
vorgelegt von
Diplom-Chemikerin Angela Then
aus
Rheinfelden (Baden)
Tag der mündlichen Prüfung:_________________
Identifizierung von Faktoren, die funktionell mit dem
Sac1p Protein in Saccharomyces cerevisiae interagieren
Gutachter: Prof. Dr. Bernhard Dobberstein
Prof. Dr. Eduard Hurt
Abkürzungen
Abkürzungen
αAA α-Aminoadipinsäure
AD(T)P Adenosin-di(tri)phosphat
ARS autonom replizierendes Segment
bp Basenpaare
Can Canavanin
CEN zentromeres Segment
cNMP cyklisches Nukleotidmonophosphat
CPY Carboxypeptidase Y
cs Kältesensitiv
DAG Diacylglycerol
DAPI 4‘6,-diamidino-2-phenylindol
DNA Desoxyribonukleinsäure
dNTP dATP, dCTP, dGTP, dTTP (2’-Desoxy(ribo)-)
dsDNA Doppelstrang-DNA
DTT Dithiothreitol
E. coli Escherichia coli
EDTA Ethylendiamintetraessigsäure
EMS Ethylmethansulfonat
5‘FOA 5‘Fluorooronsäure
GD(T)P Guanosin-di(tri)phosphat
HC Hartwell‘s-Complete Medium
His Histidin
IP3Inositol-1,4,5-trisphosphat
kDa Kilodalton
LB Luria-Bertoni-Medium
Lys Lysin
MAPK mitogen-aktivierte Protein Kinase, extrazellulär-regulierte Kinase (ERK)
mCi MilliCurie
MEK ERK-aktivierende Kinase; MAPKK, MAPK Kinase
MEKK MEK Kinase, MAPKK Kinase
nt Nukleotide
OD optische Dichte
Abkürzungen
ORF open reading frame (offener Leserahmen)
PBS Phosphate buffered saline (Phosphat gepufferte Salzlösung)
PC Phosphatidylcholin
PCR Polymerase chain reaction (Polymerase Kettenreaktion)
PI Phosphatidylinositol
PI3K PI3 Kinase
PI3P Phosphatidylinositol-3-phosphat
PI3,5P2 Phosphatidylinositol-3,5-bisphosphat
PI4,5P2Phosphatidylinositol-4,5-bisphosphat
PI3,4,5P3Phosphatidylinositol-3,4,5-trisphosphat
PITP Phophatidylinositol-Phosphatidylcholin Transfer Protein
Pkc Proteinkinase C
rER rauhes Endoplasmatisches Retikulum
rpm Umdrehungen pro Minute
RT Raumtemperatur
SDS Sodiumdodecylsulfat
ssDNA Einzelstrang-DNA
TAE Tris/Acetat/EDTA
TE Tris/EDTA
Tris Tris-(Hydroxyl)-Aminomethan
Trp Tryptophan
ts Temperatursensitiv
Ura Uracil
ü. N. über Nacht
v/v volume per volume
w/v weight per volume
YPD Hefeextrakt-Pepton-Glukose Medium
Inhaltsverzeichnis
INHALTSVERZEICHNIS
1 Zusammenfassung____________________________________________________1
2Einleitung___________________________________________________________2
2.1 Zelluläre Funktionen von Sac1p __________________________________________2
2.1.1 Sac1p ist am ATP-Transport in das ER beteiligt__________________________________ 2
2.1.2 Sac1p ist involviert in den Lipidmetabolismus ___________________________________ 3
2.1.3 Sac1p ist an der Signalübertragung durch Phosphoinositide beteiligt __________________ 4
2.2 Genetische Interaktionen in Hefe__________________________________________6
2.3 Aufgabenstellung______________________________________________________10
3 Material und Methoden ______________________________________________11
3.1 Molekularbiologische Methoden _________________________________________11
3.1.1 Bakterienmikrobiologie ___________________________________________________ 11
3.1.2 Konstruktion verwendeter Plasmide __________________________________________ 11
3.1.3 Klonierung mit Hilfe der polymerase chain reaction (PCR)________________________ 13
3.2 Hefegenetische Methoden_______________________________________________13
3.2.1 Mikrobiologische Methoden________________________________________________ 13
3.2.2 Medien ________________________________________________________________ 13
3.2.3 Genetische Manipulation von Hefen__________________________________________ 14
3.2.3.1 Transformation von Hefen____________________________________________ 14
3.2.3.2 Plasmid-Rückgewinnung aus Hefe _____________________________________ 14
3.2.3.3 Präparation genomischer Hefe-DNA ____________________________________ 14
3.2.3.4 Tetradenanalyse____________________________________________________ 14
3.2.3.5 Konstruktion von Gendeletionen _______________________________________ 14
3.2.3.5.1 Herstellung der Fragmente für die Gendeletionen_________________________ 15
3.2.3.6 Konstruktion einer Gendeletion mittels pMPY-ZAP ________________________ 15
3.2.3.7 Manipulation des Paarungstyps ________________________________________ 16
3.2.3.8 PCR mit ganzen Hefezellen___________________________________________ 16
3.2.3.9 In vivo Mutagenese mit Ethylmethansulfonat (EMS)________________________ 16
3.2.4 Konstruktion der in dieser Arbeit verwendeten Hefestämme _______________________ 17
3.3 Biochemische Methoden ________________________________________________20
3.3.1 Herstellung und Analyse von Lipidextrakten ___________________________________ 20
3.3.2 Herstellung von Mikrosomen _______________________________________________ 20
3.3.2.1 Lösungen _________________________________________________________ 20
3.3.2.2 Protokoll _________________________________________________________ 21
3.3.3 ATP-Transport-Messung __________________________________________________ 21
3.4 Mikroskopie__________________________________________________________22
3.4.1 Fluoreszenzmikroskopie___________________________________________________ 22
3.4.2 Elektronenmikroskopie____________________________________________________ 22
4 Ergebnisse _________________________________________________________23
4.1 Genetische Interaktionen von SAC1 mit Komponenten des
Inhaltsverzeichnis
Translokationsapparates _______________________________________________23
4.1.1 sac1 sec61ts und sac1
∆
sec63ts, nicht aber sac1
∆
sec62ts sind synthetisch letal ________ 25
4.1.1.1 sac1-22 komplementiert den synthetisch letalen Phänotyp von
sac1
∆
sec61ts und sac1
∆
sec63ts ________________________________________ 26
4.2 Synthetisch letaler Screen_______________________________________________27
4.2.1 Planung des Screens ______________________________________________________ 27
4.2.1.1 Konstruktion canavaninresistenter (canR) Stämme __________________________ 28
4.2.1.2 Konstruktion isogener Stämme mit unterschielichem Paarungstyp ______________ 30
4.2.1.3 Konstruktion der sac1::HIS3 und sac1::TRP1 Stämme ______________________ 30
4.2.1.4 Konstruktion des Plasmids pAT1 _______________________________________ 31
4.2.2 Durchführung des Screens _________________________________________________ 34
4.2.3 Charakterisierung der erhaltenen Mutanten ____________________________________ 36
4.2.3.1 Die Mutanten lassen sich in verschiedene Gruppen bezüglich des
ATP-Transports einteilen _____________________________________________ 37
4.2.4 Identifikation von lsa3-1 durch Komplementation mit einer chromosomalen Genbank ___ 43
4.2.4.1 Zwei unterschiedliche genomische Fragmente komplementieren lsa3-1 sac1
∆
____ 43
4.2.4.2 Ein Abschnitt von Chromosom VIII komplementiert lsa3-1___________________ 44
4.2.4.3 lsa3-1 hat einen Zellwanddefekt ________________________________________ 45
4.2.5 lsa3-1 ist ein Allel von SLT2 _______________________________________________ 45
4.2.5.1 Die lsa3-1 Mutation liegt im aktive Zentrum der Kinase _____________________ 47
4.2.5.2 Die anderen Mutanten lassen sich nicht durch die Überexpression von SLT2
komplementieren ______________________________________________________________ 48
4.3 Charakterisierung der Interaktionen von SLT2 mit SAC1 ____________________49
4.3.1 sac1
∆
slt2
∆
Zellen zeigen starken Wachstumsdefekt_____________________________ 49
4.3.2 slt2
∆
Zellen zeigen reduzierten ATP-Transport _________________________________ 50
4.3.3 slt2
∆
Zellen sind inositolauxotroph, zeigen aber keine veränderte Menge an
Phosphatidylinositol-4-phosphat (PI4P)_________________________________________________ 52
4.3.4 sac1 und slt2 Mutanten haben einen Zellwanddefekt _____________________________ 54
4.3.5 Fehlerhafte Anreicherung von Chitin zwischen Mutter- und Tochterzelle in
sac1
∆
slt2
∆
Zellen führen zu einem Separationsdefekt____________________________ 56
4.4 Epistatische Analyse ___________________________________________________62
4.4.1 SAC1 und SLT2 sind parallel zueinander aktiv __________________________________ 63
5 Diskussion _________________________________________________________65
5.1 ATP-Transport und Translokation in das ER ______________________________65
5.2 Der synthetisch letale Screen ____________________________________________66
5.3 Die MAP Kinase Slt2p interagiert genetisch mit Sac1p _______________________67
5.4 Der Sac1p Signalweg ist parallel zu der Slt2p MAPK Kaskade ________________71
6 Literatur___________________________________________________________73
∆
Zusammenfassung 1
1 ZUSAMMENFASSUNG
Sac1p ist ein integrales ER und Golgi Membranprotein der Hefe Saccharomyces cerevisiae.
Es ist beteiligt an der Regulation verschiedener zellulärer Aspekte. So reguliert Sac1p den
mikrosomalen ATP-Transport. In vitro ist die ATP-Transportrate von sac1
∆
Stämmen
drastisch reduziert und die Sekretion ist verlangsamt. Außerdem spielt Sac1p eine Rolle im
Phospholipid Metabolismus und ist an der Signalübertragung durch Phosphoinositide
beteiligt.
In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, daß sac1
∆
synthetisch letal mit
Sekretionsmutanten des Translokationsapparates ist. Die genetischen Interaktionen lassen sich
nur mit den ATP-abhängigen Faktoren SEC61 und SEC63 nachweisen, nicht aber mit SEC62,
dessen Funktion ATP-unabhängig ist. Diese Ergebnisse unterstreichen die regulatorische
Funktion von Sac1p im ATP-Transport in das ER Lumen.
Um weitere Aufschlüsse über die Funktionen von Sac1p zu erhalten, wurde ein
synthetisch letaler Screen mit sac1
∆
durchgeführt. Isoliert wurden 12 Komplementations-
gruppen, wovon nur zwei mehr als ein Allel enthalten. Die Mutanten wurden, unter
Verwendung der ATP-Transport Daten, in vier Gruppen eingeteilt. Eine Mutante, lsa3-1,
wurde weiter charakterisiert, wobei sich herausstellte, daß lsa3-1 ein Allel von SLT2 ist. Slt2p
ist eine MAP Kinase, die in die Zellwandintegrität und in polarisiertes Wachstum involviert
ist. Die lsa3-1 Punktmutation führte zu einem Austausch von Asp153 zu Asn153 im
katalytischen Zentrum von Slt2p.
Durch morphologische Untersuchungen konnte gezeigt werden, daß die synthetisch
letalen Interaktionen von slt2 und sac1 durch einen Zellseparationsdefekt verursacht werden,
der durch osmotische Stabilisierung supprimiert werden kann. Die epistatische Analyse
zeigte, daß Sac1p und Slt2p in parallelen Wegen aktiv sind.
Die in dieser Arbeit erhaltenen Daten, zusammen mit veröffentlichten Daten, lassen die
Hypothese zu, daß zum einen die Signalübertragung durch Phosphoinositide, an der Sac1p
beteiligt ist, und zum anderen die Regulation der Expression und des Transports von
Zellwandproteine, worin Slt2p involviert ist, für den Erhalt des Zellwand essentiell ist. Dies
äußert sich unter normalen Wachstumsbedingungen in der gemeinsamen essentiellen
Funktion von Sac1p und Slt2p bei der Bildung des Septums zwischen Mutter- und
Tochterzelle.
Einleitung 2
2 EINLEITUNG
Sac1p ist ein unglycosyliertes, integrales Membranprotein des ER und Golgi-Apparates mit
einem Molekulargewicht von 67 kDa (Whitters et al., 1993). Identifiziert wurde das SAC1
Gen (suppressor of actin) bei der Suche nach kältesensitiven (cs) Suppressoren für Aktin-
Mutanten (Novick et al., 1989). Das Aktincytoskelett ist in sac1 Mutanten bei der restriktiven
Temperatur delokalisiert (Novick et al., 1989). Bei der Suche nach Suppressoren der sec14-1ts
Mutation wurde ebenfalls das SAC1 Gen isoliert, was zu der Interpretation führte, daß Sac1p
ein Bindeglied zwischen sekretorischem Weg und Aktincytoskelett darstellt (Cleves et al.,
1989).
2.1 ZELLULÄRE FUNKTIONEN VON Sac1p
Sac1p zeigt verschiedene zelluläre Funktionen. Das Protein ist am ATP-Transport in Hefe-
Mikrosomen beteiligt (Mayinger et al., 1995) und ist in den Phospholipid und Phophoinositid
Metabolismus involviert (Rivas et al., 1999), (Guo et al., 1999). Sac1p scheint eine
regulatorische Rolle über Modulation von Phosphoinositid Signalen in der Zelle
einzunehmen.
2.1.1 Sac1p ist am ATP-Transport in das ER beteiligt
Für die Translokation, Faltung und Modifikationen im ER wird ATP benötigt, das durch ein
Transportsystem in das ER gelangen muß. Der mikrosomale ATP-Transport ist, wie auch der
ADP/ATP-Transport der Mitochondrien, ein elektrogener Antiport (Mayinger et al., 1995).
Im Unterschied zu den Mitochondrien, ist im ER kein Membranpotenetial charakterisiert, das
für die Regulation zuständig sein könnte. Daher wird angenommen, daß der ATP-Transport in
das ER anders reguliert wird. Als ein regulatorischer Faktor wurde Sac1p identifiziert
(Kochendorfer et al., 1999), das biochemisch aus einer Fraktion, die ATP-Transport Aktivität
zeigte, aufgereinigt wurde (Mayinger et al., 1995). Die anschließend aus sac1
∆
Stämmen
isolierten Mikrosomen zeigten eine drastisch reduzierte ATP-Transportrate, außerdem war in
diesen Stämmen der Transport und die Reifung von sekretorischen Proteinen (Präpro-α-
Einleitung 3
Faktor und Carboxypeptidase Y) vom ER zum Golgi stark verlangsamt (Mayinger et al.,
1995).
Der ausreichende Transport von ATP in das ER Lumen wird für die ATP-abhängigen
Schritte der posttranslationalen Translokation von sekretorischen Proteinen benötigt.
Vorläuferproteine binden in einer ATP-unabhängigen Reaktion an den potentiellen
Signalsequenzrezeptor, der aus Sec62p, Sec71p und Sec72p besteht. In einem ATP-
abhängigen Schritt wird durch Sec63p und Kar2p, das Hefehomolog zu BiP, das zu
translozierende Protein an die Translokationspore weitergegeben. Sec61p ist eine strukturelle
Komponente der Translokationspore, durch die die Proteine in einem weiteren ATP-
abhängigen Schritt mit Hilfe von Kar2p und Sec63p durchgeschleust werden. Kar2p benötigt
ATP, um die translozierten Proteine im Lumen des ER zu binden und korrekt zu falten
(Lyman and Schekman, 1997).
2.1.2 Sac1p ist involviert in den Lipidmetabolismus
Mehrere Phänotypen von sac1 Mutanten deuten auf eine Funktion von Sac1p im Phospholipid
Metabolismus hin. Zum einen wird die sec14ts Mutation durch sac1 Mutanten supprimiert
(Whitters et al., 1993). Widersprüchliche Modelle wurden für die Funktionen von Sac1p und
Sec14p im Phospholipid Metabolismus postuliert. Sec14p tauscht das im ER und Golgi
hergestellte Phosphatidylinositol (PI) gegen Phosphatidylcholin (PC) in Lipiddoppelschichten
aus und dient somit als Sensor für die Zusammensetzung der Phospholipide in der
Golgimembran, die essentiell für die Funktion des Golgi Komplexes ist (Kearns et al., 1998).
Von (Kearns et al., 1998) wurde ein Modell vorgeschlagen, in dem Sec14p
membrangebundenes PI einer PI-4-Kinase präsentiert und damit die Phosphoinositid
Produktion regelt. Dagegen spricht, daß in (Phillips et al., 1999) von einem Sec14pK66,239A
Allel berichtet wird, dessen PI aber nicht PC Transfer Aktivität defekt ist. Dieses Allel
stimuliert in vivo nicht die Phosphoinositid Produktion, ist aber in der Lage, die letalen
Phänotypen von sec14-1ts und sec14
∆
zu supprimieren. Dies deutet daraufhin, daß die
Bindung von PC an Sec14p der essentielle Faktor für die Aktivität von Sec14p ist (Phillips et
al., 1999). Sec14p ist auch an der Aufrechterhaltung einer kritischen Konzentration an
Diacylglycerol (DAG) im Golgi beteiligt, das für den vesikulären Transport wichtig ist. Auf
zwei Wegen wird diese Konzentration reguliert. Zum einen wird durch die Bindung von PI an
Sec14p über weitere Faktoren Phospholipase D (PLD) aktiviert, wodurch die Synthese von
Einleitung 4
DAG angeregt wird, zum anderen wird durch die Bindung von PC an Sec14p der Verbrauch
an DAG im PC-Syntheseweg (CDP-Cholin Weg) reduziert (Rivas et al., 1999). Allerdings
gibt es neuere Daten, die zeigen, daß weder die Akkumulation von DAG im Golgi (Stock et
al., 1999), noch die PLD Aktivität (Phillips et al., 1999) für die Suppression des letalen
Phänotyps der sec14-1ts Mutation benötigt werden. Dagegen wird in (Rivas et al., 1999)
beschrieben, daß das in sac1 Mutanten akkumulierte PI4P indirekt PLD aktiviert, wodurch
der Umsatz an DAG, nicht aber die gesamte Menge erhöht wird. Die resultierende
Hyperaktivität des CDP-Cholin Weges geht einher mit der Suppression von sec14ts in sac1
Mutanten. Vermutlich werden alle Elemente des SEC14-abhängigen sekretorischen Weges
durch einen bis jetzt unbekannten Mechanismus koordiniert (Stock et al., 1999).
Eine weitere Konsequenz des defekten Lipid Metabolismus ist das fehlende Wachstum
der sac1 Mutanten auf Inositol-freiem Medium. Wie in (Rivas et al., 1999) gezeigt wurde, ist
die Biosynthese von Inositol nicht defekt, da die Aktivierung der Transkription von INO1, das
für die Inositol-1-Phosphat Synthase codiert (Carman and Zeimetz, 1996), dem Wildtyp
entspricht.
2.1.3 Sac1p ist an der Signalübertragung durch Phosphoinositide beteiligt
Ein Teil der Sequenz von Sac1p, die Sac1-Domäne, zeigt Homologien zu dem Säugetier
Synaptojanin und zu den Hefe Inositol Polyphosphat-5-Phosphatasen (Inp51p, Inp52p und
Inp53p), die alle vier zu der Klasse der Inositol Polyphosphat 5-Phosphatasen (IP5Pasen)
gehören. Die Sac1-Domäne ist eine 300 Aminosäure lange Sequenz und entspricht nicht der
5-Phosphatase-Domäne (McPherson et al., 1996), (Guo et al., 1999), (Majerus, 1996). In vitro
wurde gezeigt, daß auch die Sac1-Domäne von IP5Pasen und Synaptojanin PI3,5P2, PI4P und
PI3P zu PI hydrolysieren kann, nicht aber PI4,5P2 (Guo et al., 1999). Die erhöhte Menge an
PI4P, PI3,5P2 und PI3P und erniedrigte Menge an PI4,5P2 in sac1 Mutanten (Guo et al.,
1999), (Stock et al., 1999) weisen deshalb auf eine Rolle von Sac1p in der Signalübertragung
durch Phosphoinositide hin.
Phosphorylierte Produkte von Phosphatidylinositol spielen eine kritische Rolle in der
Regulation von Membranverkehr, zusätzlich zu ihrer klassischen Rolle als Second Messenger
in der Signaltransduktion an der Zelloberfläche. Phosphorylierung und Dephosphorylierung
der polaren Köpfe von Phosphoinositiden (Polyphosphorylierten Inositol Lipiden) in
Einleitung 5
spezifischen intrazellulären Orten signalisiert entweder den Bedarf oder die Aktivierung von
Proteinen, die essentiell für den vesikulären Transport sind. Im Unterschied zu anderen
Kopfgruppen kann der Inositolring an mehreren Positionen modifiziert werden. Die
Phosphorylierung an einer Position oder einer Kombination von Positionen (3‘, 4‘ oder 5‘)
generiert fünf Stereoisomere, die als Regulatoren von vesikulären Transportreaktionen des
Cytoskeletts und des Zellwachstums fungieren. In den als klassisch bekannten Signalwegen
wird durch erhöhten Phosphatidylinositol Metabolismus die Phospholipase C aktiviert, die
Phosphatidylinositol-4,5-bisphosphat (PI4,5P2) in die beiden Second Messenger, DAG und
Inositol-1,4,5-trisphosphat (IP3), spaltet.
Weitere Signalwege werden auch durch membrangebundene Phosphoinositide
reguliert. Die biologischen Funktionen der in sac1 Mutanten angereicherten Phosphoinositide
sind hier dargestellt. Phosphatidylinositol-3-phosphat (PI3P) ist in sac1 Mutanten
angereichert (Guo et al., 1999). Es konnte gezeigt werden, daß durch Mutationen im Hefe
VPS34 Gen, das für eine PI3 Kinase (PI3K) codiert, diese Zellen Carboxypeptidase Y (CPY)
nicht mehr vom späten Golgi zur Vakuole transportieren können (Wurmser et al., 1999). PI3P
interagiert mit Proteinen, die ein Cystein-reiches Zinkfinger-ähnliches Motiv besitzen, der
FYVE Domäne (Fruman et al., 1999). PI3P und seine Bindungspartner mit FYVE Domäne
sind an einer Vielzahl von Transportschritten beteiligt, die von Vesikeln ausgeführt werden.
Das in humanen Zellen identifizierte Tumorsuppressor Gen, PTEN, codiert für eine Lipid
Phosphatase, die das Phosphat an der 3‘ Position von 3-Phosphoinositiden entfernt, aber keine
Homologien zu SAC1 hat. Dies ist auch ein Hinweis auf die potentiell pathologische Relevanz
von 3-Phosphoinositiden und PI3Ks (Leevers et al., 1999). Ein weiteres Protein, Fab1p,
bindet nicht nur PI3P an seine FYVE Domäne, sondern phosphoryliert es auch zu
Phosphatidylinositol-3,5-bisphosphat (PI3,5P2), einem weiteren Lipid Second Messenger, der
ebenfalls in sac1 Mutanten angereichert ist (Guo et al., 1999). PI3P agiert als Signal für den
anterograden vakuolaren Transport, während die Phosphorylierung zu PI3,5P2 den
retrograden vakuolären Efflux/Abbau reguliert (Wurmser et al., 1999). Sac1p könnte also ein
Regulator des vakuolären Transports sein.
PI4P ist in sac1 Mutanten angereichert (Guo et al., 1999), (Stock et al., 1999). Es
wurde angenommen, daß PI4P kein Signalmolekül ist, sondern ein Zwischenprodukt darstellt,
das entweder zu PI3,4P2 oder PI4,5P2 phosphoryliert wird (Martin, 1998). Allerdings deuten
die erniedrigten PI4,5P2 Mengen bei der Suppression der sec14-1ts Mutation durch die sac1-
22 Mutation auf eine direkte physiologische Funktion von PI4P, und nicht PI4,5P2, in SEC14-
abhängiger Sekretion (Stock et al., 1999). Zur Unterstützung dieser Bedeutung wurde von
Einleitung 6
(Matsuoka, 1998) berichtet, daß entweder PI4P oder PI4,5P2 die Bindung von Coat Proteinen
an Liposomen in einem in vitro System zur Bildung von COPII-coated Vesikeln fördert.
Das in sac1 Mutanten erniedrigte PI4,5P2 (Stock et al., 1999) ist beteiligt an der
Regulation des Golgi Apparates, der Sekretion und des Cytoskeletts. An der Synthese von
PI4,5P2, welches für einen kritischen Schritt in der Exocytose gebraucht wird, ist Sec14p
durch Präsentieren von PI an eine membrangebundene PI4 Kinase und eine cytosolische PI-4-
phosphat-5-Kinase, beteiligt (De Camilli et al., 1996). Sec14p ist ebenfalls in der
Koordination und/oder Kopplung des Phospholipid Metabolismus mit dem Vesikel Verkehr
und der Regulation von Signaltransduktions Reaktionen involviert (Kearns et al., 1998).
Physiologisch reguliert eine kompetitive Interaktion von löslichen und Lipid-
gebundenen phosphorylierten Metaboliten von Inositol die Assoziation und Dissoziation von
spezifischen Proteinen mit Membranen. Wahrscheinlich beeinflussen PIs die Regulation des
Cytoskeletts, das auf verschiedene Wege Exo- und Endocytose reguliert. In Hefe beeinflussen
Aktin Mutanten Sekretion und Endocytose, viele Aktin abhängige Proteine interagieren mit
PI4,5P2, wodurch Veränderungen an der PI4,5P2 Menge Einfluß auf die Aktin Funktion hat.
(Übersicht in (De Camilli et al., 1996).)
2.2 GENETISCHE INTERAKTIONEN IN HEFE
Die Hefe S. cerevisiae ist ein vorteilhafter Organismus, um zelluläre Mechanismen in
Eukaryonten aufzuklären. Die Zellen lassen sich recht einfach, in ausreichender Menge und in
kurzer Zeit kultivieren, sowohl die haploide als auch die diploide Form ist lebensfähig,
genetische Manipulationen sind einfach durchzuführen und das gesamte Genom ist
sequenziert und über Datenbanken zugänglich. Die Aufklärung der Funktion eines Proteins
oder des dafür codierenden Gens kann über einen biochemischen oder einen genetischen
Ansatz erfolgen, wobei die Kombination beider Methoden die meiste Information liefert. Bei
der Suche nach Komponenten des sekretorischen Weges (Novick et al., 1980) zum Beispiel,
hat sich der genetische Ansatz als hervorragendes Werkzeug erwiesen, um diesen
Stoffwechselweg aufzuklären.
Einleitung 7
Abbildung 1: Vier verschiedene Möglichkeiten, worauf synthetisch letale Interaktionen zwischen zwei Genen
beruhen können. Als Beispiel wurden SAC1 und LSA (Letal mit sac1) verwendet. (1) Physikalische
Interaktionen. (2) Sind parallel zueinander aktiv. (3) Sind im selben Weg aktiv. (4) Sind in voneinander
abhängigen Wegen aktiv. Angepaßt aus (Doye and Hurt, 1995).
Eine spezielle Methode, genetische Zusammenhänge aufzudecken, ist die Suche nach
synthetisch letalen Interaktionen mit einem mutierten Gen. Viele physikalisch und genetisch
interagierende Komponenten der Kernpore wurden durch den Einsatz von synthetisch letalen
Screens identifiziert (Doye and Hurt, 1995). Weitere synthetisch letale Screens wurden
erfolgreich durchgeführt, um Gene zu identifizieren, die an der Morphogenese beteiligt sind
(Bender and Pringle, 1991), (Costigan et al., 1992), (Holtzman et al., 1993), (Wang and
Bretscher, 1995). Bei synthetisch letalen Screens werden zwei Mutationen in
unterschiedlichen Genen gesucht, die alleine nicht letal sind, aber gemeinsam zum Tod der
Zellen führen. Dieser Effekt wird auch synthetische oder synergistische Letalität genannt.
Vier Möglichkeiten sind in Abb. 1 dargestellt, wodurch der Verlust einer essentiellen
Funktion in den Zellen ausgelöst werden kann und damit zur synthetischen Letalität führt. (1)
Physikalische Interaktion der beiden Genprodukte (Proteine), z. B. die Interaktion zwischen
Einleitung 8
Sec63p und Kar2p (Lyman and Schekman, 1995). (2) Die beiden Gene regulieren parallel
zueinander einen gemeinsamen Weg, z. B Vps1p und End4p. In vps1 Mutanten ist der
Transport vom Golgi zur Vakuole defekt, so daß End4p für den Transport über die
Plasmamembran zur Vakuole benötigt wird (Nothwehr et al., 1995). (3) Die beiden Gene sind
im selben Weg hintereinander aktiv, z. B Bet1p, das Synaptobrevin ähnlich ist, und Sec22p,
die beide zum Transport vom ER zum Golgi benötigt werden (Newman et al., 1990). (4) Die
beiden Gene sind an voneinander abhängigen Wegen beteiligt, z. B. nuklearer Protein Import
und nuklearer RNA Export (Doye and Hurt, 1995).
Wenn von zwei Genen bekannt ist oder vermutet wird, daß sie überlappende
Funktionen haben, können die genetischen Interaktionen in Hefe durch die Herstellung von
Doppelmutanten direkt getestet werden. Zwei haploide Stämme unterschiedlichen
Paarungstyps, die je ein mutiertes Allel (a, b) der zu testenden Gene (A, B) enthalten, werden
miteinander gekreuzt, der resultierende diploide Stamm (a/A, b/B) wird sporuliert und die
jeweils vier Sporen einer ausreichenden Anzahl an Tetraden werden dissektiert (Abb. 2). Die
vier Sporen in einem Ascus sind das Produkt einer einzigen meiotischen Teilung und können
zu einer der drei Klassen von Tetraden gehören, parentaler Dityp (PD), nicht-parentaler Dityp
(NPD) oder Tetratyp (T). Das Verteilungsmuster der drei verschiedenen Tetradentypen hängt
von der chromosomalen Lage der beiden Loci zueinander und zu den Centromeren ab. Aus
statistischen Gründen läßt sich dieses Verteilungsmuster erst bei einer größeren Anzahl an
analysierten Tetraden ausrechnen (Adams et al., 1997). Für die Identifizierung von
synthetisch letalen Interaktionen ist die Anzahl und die Verteilung der nicht-lebensfähigen
Sporen (a, b) von Interesse (Abb. 2).
Einleitung 9
Abbildung 2: Vereinfachtes Schema für die Analyse von genetischen Interaktionen zwischen den mutierten
Allelen a und b. Liegen die Gene A und B weit entfernt voneinander, u. U. auf verschiedenen Chromosomen und
ausreichend entfernt von den Centromeren, so ist die Verteilung der Gene willkürlich. Liegen diese zwei Gene
dicht beieinander, aber entfernt vom Centromer, so ist die Verteilung der beiden gekoppelt. Bei der Analyse von
einer ausreichenden Anzahl an Tetraden kann die Entfernung der beiden Gene voneinander berechnet werden.
Liegt ein Gen dicht am Centromer, so äußert sich auch dies im Verteilungsmuster (gut erklärt in (Adams et al.,
1997)).
A b
A b a B
Kreuzen
a B
Sporulation
3 Tetradentypen
ab
ab
AB
AB
Nonparentaler Dityp
(NPD)
Ab
aB AB
ab
Tetratyp
(T)
Ab Ab
aB aB
Parentaler Dityp
(PD)
1 : 1 : 4
>1 : <1 : 0
1 : 1 : <4
Willkürlich
Gekoppelt
Centromer
gekoppelt
Einleitung 10
2.3 AUFGABENSTELLUNG
Sac1p hat verschiedene zelluläre Funktionen in der Hefe Saccharomyces cerevisiae. Das
Protein ist am ATP-Transport in das ER, am Phosphoinositid Metabolismus und an der
polarisierten Sekretion beteiligt. Die genaue Rolle von Sac1p an diesen Vorgängen ist aber
noch nicht bekannt. Außerdem ist die Deletion von SAC1 nicht letal für die Zelle, sondern
resultiert in den oben beschriebenen Phänotypen. Daher wurde ein genetischer Ansatz
gewählt, um die Relevanz von SAC1 im ATP-Transport und im Phosphoinositid
Metabolismus aufzuklären.
Das für die Translokation und Faltung sekretorischer Proteine benötigte ATP wird mit Hilfe
von Sac1p in das ER Lumen transportiert. Wegen der Abhängigkeit der beiden Prozesse
voneinander wurde angenommen, daß sac1
∆
synthetisch letal mit bestimmten Komponenten
des Translokationsapparates ist. Daher sollten direkt die genetische Interaktion zwischen
ATP-abhängigen Komponenten des Translokationsapparates und sac1 Mutanten untersucht
werden.
Weiterhin sollte ein synthetisch letaler Screen durchgeführt werden, um aus den isolierten
Mutanten Rückschlüsse auf die Funktionen von SAC1 zu ziehen. Mit einem solchen Screen
können unvoreingenommen interagierende Faktoren identifiziert werden. Diese Faktoren
können am ATP-Transport, am Phosphoinositid Metabolismus oder an der polarisierten
Sekretion beteiligt sein. Unter anderem könnte dadurch der ATP-Transporter des ER
identifiziert werden oder Komponenten isoliert werden, durch die Sac1p reguliert wird.
Material und Methoden 11
3 MATERIAL UND METHODEN
Alle während dieser Arbeit verwendeten Chemikalien wurden, falls nicht anders erwähnt, von
Merck oder Sigma bezogen und waren von der jeweils höchsten angebotenen Qualität.
Restriktionsenzyme, DNA-modifizierende Enzyme und Polymerasen sowie ihre Puffer waren,
soweit nicht anders angegeben, von Boehringer-Mannheim. Oligonukleotide wurden von der
AG Dr. Frank (ZMBH, Heidelberg) hergestellt. DNA-Sequenzierungen wurden ebenfalls von
der AG Dr. Frank (ZMBH, Heidelberg) durchgeführt. Radioaktive Chemikalien wurden von
Amersham gekauft.
3.1 MOLEKULARBIOLOGISCHE METHODEN
Allgemeine molekularbiologische Methoden für die Klonierung in Plasmidvektoren wie
Verdau von Plasmiden mit Restrikionsendonukleasen, Phosphatase-Behandlung, Auffüllen
überhängender Enden nach Restriktionsverdaus, Auftrennen der DNA mit Agarosegelen,
Ligationen und Transformationen in kompetente E. coli wurden im wesentlichen nach den
Vorschriften von (Sambrook et al., 1989) durchgeführt. Für die Präparation von Plasmiden
aus E. coli wurden Systeme von Nucleobond und Qiagen verwendet und für die Extraktion
von DNA-Fragmenten aus Agarosegelen wurde der „Easypure Kit“ der Firma BioZym
verwendet.
3.1.1 Bakterienmikrobiologie
Für molekularbiologische Standardklonierungsmethoden wurden während dieser Arbeit die
Bakterienstämme MH1066 (Sikorski and Hieter, 1989), der ausschließlich für die Vektoren
pMPY-ZAP, pMPY-3xHA und, pMPY-3xMYC verwendet wurde, und DH5α benutzt
(Sambrook et al., 1989). Das Wachstum aller DH5α-Stämme erfolgte in LB-Medium
(Sambrook et al., 1989), dem, je nach Bedarf, 50 µg/ml Ampicillin als Antibiotikum
zugegeben wurde. Das Wachstum der MH1066-Stämme erfolgte in M9-Medium (Sambrook
et al., 1989), zu dem MgSO
4
, CaCl
2
und 1/100 Volumen 10 x YNB zugegeben wurde.
3.1.2 Konstruktion verwendeter Plasmide
Als Klonierungsvektoren wurden – je nach Experiment – die folgenden Plasmide (Hefe-
E.coli-shuttle-Vektoren) verwendet: Plasmide der Serien YCplac (Gietz and Sugino, 1988)
und pRS (Sikorski and Hieter, 1989). Plasmide, die von anderen Gruppen erhalten wurden,
sind in Tabelle 1 aufgelistet.
YCplac22/SAC1: [CEN TRP1 SAC1] pSAC1 wurde mit XbaI, AatII und NciI verdaut, das
2.4 kb großen XbaI-SAC1 Fragment, das die gesamte codierende Region von SAC1 enthielt,
wurde aus dem Agarosegel isoliert, die Enden dieses Fragments wurden aufgefüllt und poliert
und in den mit SmaI geschnittenen und dephosphorylierten Vektor YCplac22 ligiert.
Material und Methoden 12
Name des Plasmids Ursprung
pSAC1 2µ URA3 Vytas Bankaitis
pRE128 sac1::HIS3 Vytas Bankaitis
pBKS LYS2 CAN1 Frank Becker
pMPY-ZAP hisG:URA3:hisG (Schneider et al., 1996)
pMPY-3xHA HA3:URA3:HA3(Schneider et al., 1995)
pMPY-3xMYC MYC3:URA3:MYC3(Schneider et al., 1995)
pSC9 URA3 MAT
α
(Adams et al., 1997)
pSC11 URA3 MATa (Adams et al., 1997)
pCY204 CEN URA3 HO (Adams et al., 1997), (Russell et al., 1986)
psac1-22 2µ URA3 Vytas Bankaitis
YEp352::MPK1 2µ URA3 (Helliwell et al., 1998)
Tabelle 1: Plasmide von anderen Arbeitsgruppen, die in dieser Arbeit verwendet wurden.
YCplacAT1: [CEN TRP1 LYS2 CAN1 SAC1] Aus pBKS wurde mit XbaI das 9.5 kb große
LYS2/CAN1 Fragment isoliert und in das mit XbaI geschnittene Plasmid YCplac22/SAC1
ligiert.
pAT1: [CEN CAN1 LYS2 SAC1] pAT2 wurde mit AatII und NsiI verdaut, um das URA3
Gen herauszuschneiden. Mit Primern, die homologe Enden zu dem geschnittenen pAT2
haben, wurde per PCR ein 9.5 kb Fragment mit LYS2 und CAN1 aus pBKS heraus
amplifiziert. Die beiden linearen Fragmente wurden zusammen in Hefe transformiert und
ergaben durch homologe Rekombination (Ma et al., 1987) das zirkuläre Plasmid pAT1.
Name Sequenz
prAT1 5‘GATATAATTAAATTGAAGCTCTAATTTGTGAGTTTAGTATACCT
AGAGGCATCGCACAG3‘
prAT2 5‘GAAAAATAAACAAATAGGGGTTCCGCGCACATTTCCCCGAAAA
GTGCCCTAGAACTAGTGGATCCCC3‘
Tabelle 2: Für die Amplifikation des 9.5 kb LYS2/CAN1 Fragments verwendete Primer.
pAT2: [CEN URA3 SAC1] Das XbaI-SAC1Fragment (siehe YCplac22/SAC1) wurde in den
mit XbaI geschnittenen Vektor YCplac33 subkloniert.
pAT3: [CEN TRP1 sac1-22] Das XbaI Fragment von sac1-22 wurde in den mit XbaI
geschnittenen Vektor YCplac22 subkloniert.
pAT4: [CEN URA3 SLT2] Der Vektor pRS306 wurde mit SmaI und EcoRI geschnitten.
SLT2 (≡ MPK1) wurde aus dem Vektor YEp352::MPK1 isoliert, indem dieser mit SphI
linearisiert wurde, die Enden aufgefüllt wurden und dann noch ein Verdau mit EcoRI
durchgeführt wurde. Anschließend wurde das isolierte SLT2 Fragment in den vorbereiteten
Vektor ligiert.
pAT5: [URA3 SLT2] Dieses Plasmid wurde genauso hergestellt wie pAT4, mit dem
Unterschied, daß als Ausgangsvektor pRS316 verwendet wurde.
pAT6: [2µ LYS2 SAC1] SAC1 wurde aus pAT2 mit SmaI und SalI herausgeschnitten und in
den ebenfalls mit SmaI und SalI geschnittenen Vektor pRS425 ligiert.
Material und Methoden 13
3.1.3 Klonierung mit Hilfe der polymerase chain reaction (PCR)
Unter anderem für die Amplifikation des 9.5 kb LYS2/CAN1 Fragment, das zur Herstellung
von pAT1 verwendet wurde, wurde die Polymerase TaKaRa ExTaq von der Firma TaKaRa
Biomedicals, Japan, verwendet. Diese hat die Eigenschaft, längere Produkte mit weniger
Fehlern herstellen zu können. Es wurde das Protokoll des Herstellers verwendet:
< 1 µg DNA 5 min 95°C
100 pmol Primer I 25 Zyklen: 1 min 95°C
100 pmol Primer II 1 min 55°C
10 µl Ex Taq 10 x Puffer 1min/kb 72°C
8 µl 2,5 mM dNTPs 5 min 72°C
H2O +4°C
0,3 µl TaKaRa Ex Taq (5 units/µl)
ΣV = 100 µl
3.2 HEFEGENETISCHE METHODEN
3.2.1 Mikrobiologische Methoden
Allgemeine Methoden der Hefemikrobiologie wie die Erzeugung diploider Stämme aus
haploiden Stämmen durch Kreuzung, Sporulation diploider Zellen, Zerlegung von
sporulierten Asci und Tetradenanalyse wurden nach (Adams et al., 1997) durchgeführt. Das
Wachstum von Hefen in Flüssigmedien wurde durch Bestimmung der Absorption (optischen
Dichte, OD) bei 600 nm mit einem Photometer verfolgt. 1 OD600 entspricht dabei etwa 3x 107
Zellen/ml. Um die Zelldichte sehr genau zu bestimmen (für Transformationen mit hoher
Effizienz), wurde eine Neugebauer Zählkammer verwendet.
3.2.2 Medien
Alle Hefestämme wurden in Standardmedien inkubiert (Adams et al., 1997). Vollmedien
enthielten 1% Hefeextrakt, 2% Bacto-Peptone (beides von Gibco) und 2% Glukose (YPD).
Für die Herstellung selektiver Medien wurde das Protokoll für Hartwell’s Complete (HC)
Medium (Adams et al., 1997) verwendet. 5‘-Fluorooronsäure-haltige Platten (5‘FOA),
Canavanin-haltige Platten (Can) und α-Aminoadipinsäure-haltige Platten (αAA) wurden
ebenfalls nach (Adams et al., 1997) hergestellt und verwendet. Inositolfreies Medium wurde
nach (Klig et al., 1985) hergestellt. Zur Herstellung fester Medien wurde den oben
beschriebenen Medien 2% Agar (Gibco) zugegeben. Um Zellwanddefekte zu testen, wurden
entweder Calcofluor Weiß (CFW) Platten durch Zugabe von 0.02 mg/ml CFW oder SDS
Platten durch Zugabe von 0.03% SDS zu dem entsprechenden Medium hergestellt (Igual et
al., 1996).
Material und Methoden 14
3.2.3 Genetische Manipulation von Hefen
3.2.3.1 Transformation von Hefen
Zur Transformation von Plasmiden wurde die modifizierte Lithiumacetat Methode
angewendet. Für die Konstruktion von Gendeletionen durch Transformation mit linearen
DNA Fragmenten oder die Transformation mit der chromosomalen Genbank, wurde das
Transformationsprotokoll für hohe Effizienz mit der Lithiumacetat-Methoden von (Adams et
al., 1997) verwendet.
3.2.3.2 Plasmid-Rückgewinnung aus Hefe
Die Präparation von Plasmid-DNA aus Hefe erfolgte nach der Vorschrift von (Hoffman and
Winston, 1987). 1.5 µl der wässrigen Phase wurden in E. coli transformiert, Plasmid-
enthaltende positive Klone amplifiziert und die DNA aufgereinigt.
3.2.3.3 Präparation genomischer Hefe-DNA
Standardmäßig erfolgte die Präparation von genomischer Hefe-DNA nach dem Protokoll von
(Hoffman and Winston, 1987). Die gewonnene DNA war frei von RNA und wurde in TE (pH
8.0) bei 4°C gelagert.
3.2.3.4 Tetradenanalyse
Die Sporulation diploider Hefestämme wurde entweder wie in (Adams et al., 1997)
beschrieben oder in 1% Kaliumacetet-Flüssigkultur bei RT durchgeführt. Um den Ascus der
Tetraden abzubauen, wurde 1 ml der Sporulationskultur pelletiert, zwei mal mit Wasser
gewaschen und dann in ca. 1 ml Wasser aufgenommen. 200 µl dieser Hefelösung wurden mit
200µl Zymolyaselösung gemischt, 10 Minuten bei RT inkubiert und danach auf Eis gestellt.
18 µl dieser Lösung wurden vorsichtig auf eine YPD-Platte aufgetragen, so daß die Platte in
zwei Hälften geteilt wurde. Nach dem Trocknen der Platte wurden die Tetraden zerlegt.
Zymolyase-Lösung: 2 mg Zymolyase SE-Lösung: 0.12 g Tris
15 mg DTT 0.97 g EDTA
2 ml SE-Lösung pH 8.0 mit NaOH
Wasser
(immer frisch ansetzten) ΣV = 100 ml
3.2.3.5 Konstruktion von Gendeletionen
Um die verschiedenen Gendeletionen herzustellen, wurde die auf PCR-basierende ein-Schritt
Methode (Baudin et al., 1993) (Lorenz et al., 1995) verwendet. Diese Technik nutzt aus, daß
homologe Rekombination in Hefe sehr effizient mit linearen DNA Fragmenten stattfindet,
wobei eine Homologie von ~ 40 bp ausreichend ist. Die Primer wurden so ausgewählt, daß
sich 40 nt des Zielgens am 5‘ Ende des Primers befanden, gefolgt von der Sequenz, um den
gewünschten Marker von einem Plasmid der pRS400-Serie (Sikorski and Hieter, 1989) zu
amplifizieren. Da diese Sequenz immer die gleiche war, konnte der Marker nach Belieben
ausgewählt werden. Es wurde exakt nach dem Protokoll von (Adams et al., 1997) gearbeitet.
Material und Methoden 15
Gen Name der
Primer
Sequenz
SAC1 SAC1/5-pRS400 5‘CGTAAGATGCAATGGCATAGAGTGAAATTGTTAAT
TGATCAGATTGTACTGAGAGTGCAC3‘
SAC1 SAC1/3-pRS400 5‘TATCGTAGCACCTAAAACGGTCAAGGCTGCGCAAA
TGATCCTGTGCGGTATTTCACACCG3‘
SLT2 SLT2-5‘ 5‘AGTAGAAATAATTGAAGGGCGTGTATAACAATTCT
GGGAGAGATTGTACTGAGAGTGCAC3‘
SLT2 SLT2-3‘ 5‘TCTATGGTGATTCTATACTTCCCCGGTTACTTATAGT
TTTCTGTGCGGTATTTCACACCG3‘
PKC1 PKC1-3disr ATATAAAATTAAATAAATCATGGCATGACCTTTTCTC
GACTCACTATAGGGAGACCG
PKC1 PKC1-5disr TATAGTATCACACATATAGGGAGCAGTTTACAGTCCA
CATACGATTTAGGTGACAC
Tabelle 3: Alle für die verschiedenen Gendeletionen verwendeten Primer.
3.2.3.5.1 Herstellung der Fragmente für die Gendeletionen
Die in (Adams et al., 1997) beschriebene Methode wurde leicht modifiziert. Das PCR-
Gemisch wurde wie angegeben angesetzt, nur das PCR Zyklus Profil wurde verändert:
10 - 100 ng linearisierte DNA 5 min 95°C
25 pmol Primer I 25 Zyklen: 1 min 95°C
25 pmol Primer II 1 min 50°C
5 µl 10 x Puffer 1min/kb 72°C
5 µl 2 mM dNTPs 5 min 72°C
H2O +4°C
0.2 µl Taq (5 units/µl)
ΣV = 50 µl
3.2.3.6 Konstruktion einer Gendeletion mittels pMPY-ZAP
Name des Primers Sequenz
CAN1/5-ZAP 5‘CGAGAGTAAATGGCGAGGATACGTTCTCTATGGAGGA
TGGAGGGAACAAAAGCTGG3‘
CAN1/3-ZAP 5‘CACCATTGAATTTTGGTGCAAAAGCCGTGAAACCTTGA
ATCTATAGGGCGAATTGG3‘
CAN1-5 5‘GTATCCATTGCGCTCTTTCCCG3‘
CAN1-3 5‘GAGATATAGGCGGCAGCAAAGC3‘
Tabelle 4: Verwendete Primer: Mit den Primern CAN1/5-ZAP und CAN1/3-ZAP wurde das lineare DNA-
Fragment für die Deletion hergestellt, mit CAN1-5 und CAN1-3 wurde die Deletionen per PCR analysiert.
Da die Anzahl der Marker in einem Hefestamm begrenzt ist, wurde für die Konstruktion von
ATY6211 aus SEY6210 das CAN1 Gen in zwei Schritten gegen das bakterielle hisG Gen
ersetzt. Die Deletion reicht von Base 209 bis 1533 nach dem Start Codon in CAN1. Dazu
wurde der Vektor pMPY-ZAP mit NaeI linearisiert und als Vorlage in die PCR eingesetzt.
Material und Methoden 16
Als Primer wurden CAN1/5-ZAP und CAN1/3-ZAP verwendet (Tabelle 4). Das erhaltene 2.1
kb große Fragment (5‘-40 nt CAN1-hisG:URA3:hisG-40 nt CAN1-3‘) wurde aufgereinigt und
zur Transformation eingesetzt. Die Kolonien wurden auf HC-Ura Platten selektiert und per
PCR analysiert. Die positiven Klone wurden in YPD hochgezogen, so daß das URA3 Gen und
eine Kopie des hisG Gens durch interne homologe Rekombination herausfallen konnte. Für
Kolonien, bei denen dieser Prozess stattgefunden hatte, wurde auf 5‘FOA-Platten selektiert.
Die hochgewachsenen Kolonien wurden wieder in der PCR analysiert. Als analytische Primer
wurden beide Male CAN1-5 und CAN1-3 eingesetzt (Tabelle 4). Es wurde exakt nach der
beschriebenen Prozedur (Schneider et al., 1996) gearbeitet.
3.2.3.7 Manipulation des Paarungstyps
In zwei Schritten wurde aus ATY6211 (MAT
α
) der isogenen MATa Stamm ATY6213
hergestellt. Dazu wurde ATY6211 mit dem mit EcoRI linearisierten Plasmid pSC11
transformiert. Die positiven Klone wurden auf HC-Ura selektiert und anschließend in YPD
hochgezogen. Diese Kultur wurde mit Wasser gewaschen, verdünnt und ein Teil davon auf
einer 5‘FOA-Platte ausgestrichen. Von den hochgewachsenen Kolonien wurden 72 Kolonien
und der Ausgangsstamm auf eine YPD Platte aufgetragen und nach dem Hochwachsen mit
einem MATa und einem MATα Testerstamm gekreuzt. Es wurde exakt nach dem Protokoll
von (Adams et al., 1997) gearbeitet.
3.2.3.8 PCR mit ganzen Hefezellen
Für die Überprüfung der erfolgten Manipulationen im Genom der Hefezellen wurde eine
analytische PCR durchgeführt. Die eingesetzten Primer (siehe Anhang) wurden so gewählt,
daß sie sich außerhalb der veränderten Region anlagern. Von dem zu analysierenden Stamm
wurden wenige Hefezellen als Vorlage eingesetzt, anstatt aufgereinigte genomische DNA
einzusetzen. Diese Methode läßt sich gut auf zu amplifizierende Fragmente unter ~2 kb
anwenden. Es wurde exakt nach dem Protokoll von (Adams et al., 1997) gearbeitet.
3.2.3.9 In vivo Mutagenese mit Ethylmethansulfonat (EMS)
Für die in vivo Mutagenese der Stämme ATY6215 und ATY6216 nach (Adams et al., 1997)
wurden Zellen in YPD-Medium bei 30°C bis in die stationäre Phase (~1.3 x 108 Zellen/ml)
hochgezogen. 2 x 108 Zellen wurden geerntet, zwei mal mit sterilem Wasser gewaschen und
in 1.0 ml sterilem 0.1 M Natrium-Phosphatpuffer (pH 7) resuspendiert. Die exakte Zelldichte
wurde mittels einer Neugebauer Zählkammer bestimmt. Diese Suspension wurde halbiert, zu
dem einen Aliquot wurden 15 µl EMS zugegeben, das andere diente als nicht-mutagenisierte
Kontrolle, um später die Überlebensrate zu bestimmen. Beide Gefäße wurden eine Stunde bei
30°C inkubiert. Die Zellen wurden anschließend pelletiert, in sterilem Wasser aufgenommen,
in ein frisches Gefäß überführt und dann zwei mal mit 5% Natrium Thiosulfat gewaschen. Die
mutagenisierten Zellen wurden in 500 µl Wasser aufgenommen und um den Faktor 8.3 x 10-5
verdünnt (2.5 µl auf 30 ml). Davon wurden je 210 µl auf insgesamt 110 YPD Platten
ausgestrichen. Die Referenz wurde 2 x 10-5 fach verdünnt und es wurden je 100 µl auf
insgesamt vier YPD Platten ausgestrichen. Die Platten wurden drei Tage bei 25°C inkubiert.
Material und Methoden 17
3.2.4 Konstruktion der in dieser Arbeit verwendeten Hefestämme
Alle Hefestämme, die während dieser Arbeit von anderen Arbeitsgruppen erhalten wurden,
sind in Tabelle 5 aufgelistet und alle Hefestämme, die während dieser Arbeit konstruiert
wurden, sind in Tabelle 6 aufgelistet.
YM1864(5): Die Stämme YM1864 und YM1865 wurden zwar im Labor von Vytas Bankaitis
hergestellt, aber die Deletion des SAC1 Gens wurde dort nicht mehr verifiziert. Hierzu wurde
mit den beiden Stämmen YM1864 und YM1865 eine analytische PCR mit ganzen Hefezellen
durchgeführt. Mit den Primern SAC1 3in2 und SAC1 5in wurde für sac1::HIS3 ein Fragment
von 2.1 kb amplifiziert. Mit den gleichen Primern zeigt die Wildtyp Kontrolle ein Fragment
von 0.9 kb.
Name Genotyp Ursprung
YM1862 MATa ura3-52 his3-200 ade2-101 lys2-801 met- canR reg1-501
LEU2::GAL1-lacZ
(Hovland et al., 1989)
YM1863 MAT
α
ura3-52 his3-200 ade2-101 lys2-801 canR reg1-501
LEU2::GAL1-lacZ
(Hovland et al., 1989)
YM1864 YM1862 sac1::HIS3 Vytas Bankaitis
YM1865 YM1863 sac1::HIS3 Vytas Bankaitis
SEY6210 MAT
α
trp1-delta901 leu2-3,112 his3-delta200 ura3-52 lys2-
801 suc2-delta9
(Hong et al., 1996)
J51-5c MAT
α
ura3-52 leu2-3-112 his4 trp1 ade2-101 ptl1 (sec63ts)David Meyer
RSY529 MAT
α
ura3-52 leu2,3-112 his4-6/9 sec62-1ts (Lyman and Schekman,
1997)
YOO98 MATa trp1 his3 ura3 ade2 sec61-2ts Stefan Jentsch
YOO08 MATa leu2 ura3 trp1 his4 sec61-3ts Stefan Jentsch
RSY926 MAT
α
ade2-101 ura3-52 his3
∆
200 leu2
∆
1 trp1
∆
1 suc2
sec71::LEU2
(Lyman and Schekman,
1997)
RSY1006 MAT
α
ade2-101 lys2-801 his3
∆
200 leu2
∆
1 sec71::HIS3 (Lyman and Schekman,
1997)
YG0038 MATa ade2-101 ura3-52 leu2,3-112 trp1 lys2 kar2-203ts (te and Aebi, 1994)
YG0041 MATa ade2-101 ura3-52 leu2,3-112 his3
∆
200 lys2 kar2-159ts (te and Aebi, 1994)
YG0044 MATa ade2-101 ura3-52 his3 lys2 kar2-1ts (te and Aebi, 1994)
ATY355
(W303 1A)
MATa ade2-1 trp1-1 can1-100 leu2-3,112 his3-11,15 ura3
GAL psi+
Ralf Jansen
ATY356
(W303 1B)
MAT
α
ade2-1 trp1-1 can1-100 leu2-3,112 his3-11,15 ura3
GAL psi+
Ralf Jansen
ATY357
(#72)
MAT
α
his3 leu2 ade2 trp1 ura3 can1-100 bni1::URA3 Ralf Jansen
ATY358
(#73)
MAT a his3 leu2 ade2 trp1 ura3 can1-100 bni1::URA3 Ralf Jansen
ATY373
(#470)
MATa/MAT
α
ade2-1/ade2-1 trp1-1/trp1-1 can1-100/can1-100
leu2-3,112/leu2-3,112 his3-11,15/his3-11,15 ura3/ura3 GAL
psi+
Ralf Jansen
TSY807 MATa his3-delta200 leu2-3,112 lys2-801 ura3-52 Tim Stearns
Tabelle 5: Verwendete Hefestämme
ATY307: Die beiden Stämme RSY529 und YM1864 {pAT2} wurden gekreuzt, der
resultierende diploide Stamm sporuliert und die Tetraden wurden dissektiert. Die aus den
Sporen hochgewachsenen Kolonien wurden auf 5‘FOA Platten ausgestrichen und
Material und Methoden 18
anschließend nach den beiden Phänotypen ts (für sec62-1) und cs (für sac1::HIS3) untersucht.
Es wurde der Stamm gewählt, der sowohl ts als auch cs war.
ATY308: Die beiden Stämme YOO98 und YM1865 {pAT2} wurden gekreuzt, der
resultierende diploide Stamm sporuliert und die Tetraden wurden dissektiert. Die aus den
Sporen hochgewachsenen Kolonien wurden nach dem ts Phänotypen für sec61-2 und auf HC-
His Platten (für sac1::HIS3) untersucht. Es wurde der Stamm gewählt, der sowohl ts als auch
His+ war.
ATY309/ATY310: Die beiden Stämme YOO08 und YM1864 {pAT2} wurden gekreuzt, der
resultierende diploide Stamm sporuliert und die Tetraden wurden dissektiert. Die aus den
Sporen hochgewachsenen Kolonien wurden nach dem ts Phänotypen für sec61-3 untersucht.
und wurden auf 5‘FOA Platten ausgestrichen, auf denen die Doppelmutanten sac1
∆
sec61-3
nicht wachsen können. Mit diesen Stämmen wurde weitergearbeitet.
Name Genotyp
ATY307 sec62-1 sac1::HIS3 pAT2
ATY308 MAT
α
his3-200 ura3-52 ade2-101 trp1 sec61-2 sac1::HIS3 pAT2
ATY309 MATa his3-200 ura3-52 ade2-101 trp1 canR sec61-3 sac1::HIS3 pAT2
ATY311-1/-2 MAT
α
ura3-52 leu 2,3-112 his4 his3-200 trp1 ade2-101 canR(-1) sec63 sac1::HIS3 pAT2
ATY331 MATa trp1-delta901 leu2-3,112 his3 delta200 ura3-52 lys2-801 suc2-delta9 can1::hisG
sac1::HIS3 slt2::TRP1 pAT1
ATY336
ATY337
MAT
α
trp1-delta
901 leu2-3,112 his3-delta200 ura3-52 lys2-801 suc2-delta9 can1::hisG
slt2::HIS3 (slt2::TRP1)
ATY338
ATY339
MATa trp1-delta 901 leu2-3,112 his3-delta 200 ura3-52 lys2-801 suc2-delta 9 can1::hisG
slt2::HIS3 (slt2::TRP1)
ATY352 trp1-delta901 leu2-3,112 his3-delta200 ura3-52 lys2-801 suc2-delta9 can1::hisG
sac1::TRP1 slt2::HIS3
ATY359-1/-2 bni1::URA3 sac1::TRP1
ATY6211 MAT
α
trp1-delta901 leu2-3,112 his3-delta200 ura3-52 lys2-801 suc2-delta9 can1::hisG
ATY6212 MAT
α
trp1-delta901 leu2-3,112 his3-delta200 ura3-52 lys2-801 suc2-delta9 can1::hisG
sac1::TRP1
ATY6213 MATa trp1-delta901 leu2-3,112 his3-delta200 ura3-52 lys2-801 suc2-delta9 can1::hisG
ATY6214 MATa trp1-delta901 leu2-3,112 his3-delta200 ura3-52 lys2-801 suc2-delta9 can1::hisG
sac1::HIS3
ATY6215 ATY6212 pAT1
ATY6216 ATY6214 pAT1
ATY6218 MATa trp1-delta901 leu2-3,112 his3-delta200 ura3-52 lys2-801 suc2-delta9 can1::hisG
sac1::TRP1
ATY6219 ATY6218 pAT1
ATY369 ATY373 pkc1::HIS3MX
ATY371 MATa ade2-1 trp1-1 can1-100 leu2-3,112 his3-11,15 ura3 GAL psi+ pkc1::HIS3MX
Tabelle 6: In dieser Arbeit konstruierte Hefestämme
ATY311/ATY312/ATY313: Die beiden Stämme J51-5c und YM1864 {pAT2} wurden
gekreuzt, der resultierende diploide Stamm sporuliert und die Tetraden wurden dissektiert.
Die aus den Sporen hochgewachsenen Kolonien wurden nach dem ts Phänotyp für sec63
untersucht und wurden auf 5‘FOA Platten ausgestrichen, auf denen die sac1
∆
sec63
Doppelmutanten nicht wachsen können. Mit diesen Stämmen wurde weitergearbeitet.
Material und Methoden 19
ATY6211: In zwei Schritten wurde in dem Stamm SEY6210 das CAN1 Gen durch das
bakterielle hisG Gen ersetzt. Mit Hilfe des pMPY-Vektors wurde verfahren, wie unter Kapitel
3.2.3.6 beschrieben.
ATY6212: Wie unter Kapitel 3.2.3.5 beschrieben, wurde in dem Stamm ATY6211 das SAC1
Gen durch das TRP1 Gen ersetzt. Die Deletion reicht von bp 1363 bis bp 1887 der
codierenden Region von SAC1 (Cleves et al., 1989).
ATY6213: Um den zu ATY6211 (MAT
α
) isogenen MATa Stamm ATY6213 herzustellen,
wurde ATY6211 mit dem mit EcoRI linearisierten Plasmid pSC11 transformiert. Es wurde
exakt nach dem Protokoll von (Adams et al., 1997) gearbeitet.
ATY6214: Wie unter Kapitel 3.2.3.5 beschrieben wurde in dem Stamm ATY6213 das SAC1
Gen durch das HIS3 Gen ersetzt. Die Deletion reicht von bp 1363 bis bp 1887 der
codierenden Region von SAC1 (Cleves et al., 1989).
ATY6218: Wie unter Kapitel 3.2.3.5 beschrieben wurde in dem Stamm ATY6213 das SAC1
Gen durch das TRP1 Gen ersetzt. Die Deletion reicht von bp 1363 bis bp 1887 der
codierenden Region von SAC1 (Cleves et al., 1989).
ATY331: Im Stamm ATY6216 wurde der gesamte ORF (bp 1 - 1460) von SLT2 durch TRP1
ersetzt. Es wurde vorgegangen, wie in Kapitel 3.2.3.5 beschrieben. In den Stämmen
ATY6211, ATY6213 und SEY6210 wurde ebenfalls SLT2 mit TRP1 deletiert (ATY337,
ATY339 und ATY344) und in den Stämmen ATY6211, ATY6213 und TSY807 wurde SLT2
mit HIS3 deletiert (ATY336, ATY338 und ATY341).
ATY352: Die beiden Stämme ATY338 und ATY6212 wurden gekreuzt, der resultierende
diploide Stamm sporuliert und die Tetraden wurden dissektiert. Es wurden die Kolonien
gewählt, die sowohl auf Histidin-freiem als auch auf Tryptophan-freiem Medium wachsen
konnten (slt2::HIS3 sac1::TRP1).
ATY359: Die beiden Stämme ATY358 und ATY6212 wurden gekreuzt, der resultierende
diploide Stamm sporuliert und die Tetraden wurden dissektiert. Es wurden die Kolonien
gewählt, die sowohl auf Uracil-freiem als auch auf Tryptophan-freiem Medium wachsen
konnten (bni1::URA3 sac1::TRP1).
ATY369: Im Stamm ATY373 wurde der gesamte ORF (bp 1 - 3456) von PKC1 durch HIS3
ersetzt. Die HIS3MX Kassette und die Primer für die Amplifikation des Fragments für die
Deletion wurden von der Arbeitsgruppe von M. Hall (Biozentrum Basel) erhalten. Es wurde
vorgegangen, wie in Kapitel 3.2.3.5 beschrieben.
ATY371: Der Stamm ATY369 wurde sporuliert, die resultierenden Tetraden wurden nach
dem Protokoll der „Random Spore Analysis“ (Adams et al., 1997) behandelt. Die so
vereinzelten Sporen wurden auf HC-His + 1 M Sorbitol ausplattiert, damit nur pkc1::HIS3
Zellen hochwachsen können. Auf diese Weise wurde ein Stamm isoliert.
Material und Methoden 20
3.3 BIOCHEMISCHE METHODEN
3.3.1 Herstellung und Analyse von Lipidextrakten
Die Zellen wurden über Nacht bei 30°C in Inositol-freiem Medium mit 0.1 mM Inositol
hochgezogen, am Morgen auf 0.3 OD600 eingestellt und noch mal für ein bis zwei Teilungen
inkubiert. 3 OD600 Zellen in 3 ml wurden 20 Minuten bei 25°C mit 1 µCi [14C]-myo-Inositol
markiert, dann pelletiert, zwei Mal mit eiskaltem Wasser gewaschen, in 0.3 ml Wasser
resuspendiert, 1.2 ml Ethanol zugegeben und 45 Minuten bei 95°C im Wasserbad erhitzt.
Danach wurden 2 ml 0.1 M KCl 0.1 N HCl, 7.5 ml CHCl3/MeOH/1 N HCl (495:990:15) und
2.5 ml CHCl3 zugegeben und gut gemischt. Es wurden noch mal 2.5 ml 2 M KCl 0.01 N HCl
zugegeben, gut gemischt und dann zentrifugiert, um die beiden Phasen zu trennen. Die obere
(wässrige) Phase wurde verworfen und die untere (organische) wurde mit 7.6 ml 2 M KCl
0.01 N HCl gewaschen. Anschließend wurde die organische Phase im Stickstoffstrom
getrocknet und die isolierten Lipide in 50 – 100 µl CHCl3/MeOH/1 N HCl (495:990:15)
aufgenommen.
Die Lipide wurden per Dünnschichtchromatographie aufgetrennt und in der Jodkammer
angefärbt, die radioaktiven Signale wurden durch Fluorographie mit Hilfe eines BAS1000
Phosphoimager (Fuji, Japan) und der vom Hersteller gelieferten Software (MacBas 2.0)
analysiert. Als Laufmittel wurde 1-Propylacetat/2-Propanol/Ethanol/6% aq. NH4OH (3:9:3:9)
verwendet, die benutzten Platten waren TLC silica gel HL plate von Analtech Uniplate, USA
(Katalog Nr. 46011).
3.3.2 Herstellung von Mikrosomen
In den aus dem Screen erhaltenen Mutanten wurde der ATP-Transport in das ER gemessen.
Zu diesem Zweck wurden Mikrosomen isoliert. Dazu wurde zuerst die Zellwand mit
Zymolyase verdaut, das Enzym wurde danach über Zentrifugation durch ein Sucrose/Ficoll-
Kissen entfernt. Anschließend wurden die Zellen homogenisiert und die Mitochondrien und
andere schwere Zellbestandteile mittels Zentrifugation durch ein Sucrose-Kissen von den
Mikrosomen getrennt. Die Mikrosomen wurden durch einen weiteren Zentrifugationsschritt
angereichert.
3.3.2.1 Lösungen
Tris-Sulfat Puffer: 100 mM Tris-Sulfate pH 9.4 plus 10 mM DTT
Sorbitol-Puffer: 1.2 M Sorbitol
20 mM Kpi Puffer pH 7.4
5 mM DTT (frisch zugegeben)
Spheroblasten-Medium: Sorbitol-Puffer, der mit YPD statt Wasser angesetzt wurde
Sucrose/Ficoll-Puffer: 0.8 M Sucrose
1.5% (w/v) Ficoll 400
20 mM HEPES pH 7.4
Membran-Lyse-Puffer: 50 mM KOAc
2 mM EDTA
20 mM HEPES pH 7.4
2 mM DTT (frisch zugegeben)
Material und Methoden 21
0.5 M Sucrose: 0.5 M Sucrose
50 mM KOAc
2 mM EDTA
20 mM HEPES pH 7.4
1 mM DTT (frisch zugegeben)
1.0 M Sucrose: wie unter 0.5 M Sucrose beschrieben, aber mit 1.0 M Sucrose
Membran-Puffer: 0.25 M Sucrose
50 mM KOAc
1 mM DTT (frisch zugegeben)
20 mM HEPES pH 7.4
20 µg/ml PMSF
3.3.2.2 Protokoll
Eine 1 l Hefekultur wurde über Nacht bei 30°C bis zu einer OD600 von 1.0 – 1.5 hochgezogen.
Die Zellen wurden pelletiert, mit Tris-Sulfat-Puffer (ohne DTT) gewaschen und das Volumen
des Pellets notiert. Dieses Pellet wurde entweder bei –80°C gelagert oder gleich
weiterverarbeitet. Das Pellet wurde in 20 ml Tris-Sulfat-Puffer (mit DTT) resuspendiert und
30 Minuten bei 30°C inkubiert. Danach wurden die Zellen wieder pelletiert und einmal mit
Sorbitol-Puffer gewaschen. Das Pellet wurde bis zu einem Endvolumen von 20 ml in
Spheroblasten-Medium aufgenommen, das 20 mg Zymolyase enthielt. Während der 90
minütigen Inkubation bei 30°C mit langsamem Schütteln wurde die Zellwand abgebaut.
Anschließend wurde die Suspension auf 10 ml 0.8 M Sucrose-Ficoll-Kissen geschichtet und
15 Minuten bei 4°C und 5000 rpm im Sorvall SS-34 Rotor zentrifugiert. Der Überstand wurde
verworfen, das Spheroblasten-Pellet wurde in Membran-Lyse-Puffer mit 50 µl PMSF bis zu
einem Endvolumen von 20 ml aufgenommen und im Potter homogenisiert. Dazu wurden 20
ml 0.5 M Sucrose zugegeben, gemischt, dieses Homogenat wurde dann auf 10 ml 1.0 M
Sucrose geschichtet und dann 15 Minuten bei 4°C und 8000 rpm im Sorvall HB-4 Rotor
zentrifugiert. Der so erhaltene Überstand und die Interphase wurden vorsichtig abgenommen
und die darin enthaltenen Mikrosomen 30 Minuten bei 4°C und 15000 rpm im Sorvall SS-34
Rotor pelletiert. Das resultierende Membranpellet wurde vorsichtig in einer angemessenen
Menge Membran-Puffer resuspendiert. 10 µl der Suspension wurden 1:100 in 2% SDS
verdünnt, um die OD280 zu bestimmen und die Ausbeute zu berechnen. Für die Messung des
ATP-Transports wurden drei Aliquots auf 10 OD280/ml in je 300 µl eingestellt. Die
Membranen wurden in flüssigem Stickstoff eingefroren und bei –80°C gelagert.
3.3.3 ATP-Transport-Messung
Um den ATP-Transport ins ER zu untersuchen, wurde die ATP-Menge gemessen, die in einer
bestimmten Zeit in Hefe-Mikrosomen durch aktiven Transport aufgenommen wurde.
Radioaktiv markiertes ATP wurde zu den Mikrosomen gegeben und nach bestimmten
Zeitabständen wurden die Mikrosomen auf Anionenaustauschersäulen gegeben, um nicht-
aufgenommenes ATP zu entfernen, welches an das Säulenmaterial bindet. Die verbliebene
ATP-Menge im Säulendurchfluß, d. h. in die Mikrosomen transportiertes ATP, wurde anhand
eines Szintillationszählers ermittelt.
Als erstes wurden kleine Glassäulen mit 150 mg Dowex in 500 µl 250 mM Sucrose 10 mM
HEPES gefüllt, die präparierten Mikrosomen wurden auf Eis aufgetaut und es wurde
Material und Methoden 22
nochmals die OD280 der Proben bestimmt. Um den mitochondrialen ADP/ATP Transporter zu
inhibieren, der mit den Mikrosomen aufgereinigt wurde und dadurch das Ergebnis des
Transports in das ER verfälscht, wurden vor Beginn der Messung 3 µl 10 mM Atractylosid
(ATR) zugegeben und dann 10 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert, bevor 15 µl 1 mM
[14C]ATP zugegeben wurden. Nach 20, 40, 70, 120 und 300 Sekunden wurden 50 µl des
radioaktiven Gemischs auf die Säule gegeben, mit 100 µl 250 mM Sucrose 10 mM HEPES
nachgespült und vorsichtig eluiert. Für die Bestimmung des Nullwerts wurde zum restlichen
Membranenansatz 10 µl 10% Triton X-100 zugegeben, um die Mikrosomen aufzulösen, und
dann ebenfalls über die Säule gegeben. Das gesamte Eluat wurde in Szintillationsflüssigkeit
gegeben, die „counts per minute (cpm)“ wurden im Szintillationsgerät gemessen und die
Auswertung erfolgte dann folgendermaßen:
• aufgenommenes ATP (pmol): Von den cpm der jeweiligen Probe wurde der Nullwert
abgezogen, und der so erhaltene Wert wurde durch die spezifische Aktivität des
eingesetzten [14C]ATP geteilt.
• aufgenommenes ATP (µmol/g protein): Da 1 OD280 der Membranen 3.5 mg/ml Protein
entsprechen und 50 µl Mikrosomen eingesetzt wurden, wurde der Wert des
aufgenommenen ATPs mit 3.5 multipliziert und durch 50 und die OD280 der jeweiligen
Probe dividiert.
3.4 MIKROSKOPIE
3.4.1 Fluoreszenzmikroskopie
Um die Zellkerne sichtbar zu machen, wurden ~107 Zellen in 70% Ethanol fixiert und dann
mit 50 ng/ml DAPI angefärbt. Für die Auswertung wurde ein UV-Filter verwendet (Adams et
al., 1997).
Für das Anfärben des Chitins in der Zellwand wurden zu ~107 Zellen im Medium 100 µg/ml
Calcofluor Weiß gegeben und kurz inkubiert. Für die Auswertung wurde ein UV-Filter
verwendet (Adams et al., 1997).
3.4.2 Elektronenmikroskopie
Die Zellen einer Übernachtkultur wurden zwei Mal mit 100 mM Citratpuffer pH 4.7
gewaschen und dann nach dem Protokoll von Frank Vogel (MDC Berlin-Buch) in 4%
Formaldehyd, 0.5% Glutaraldehyd in 100mM Citratpuffer pH 4.7 bei 30°C fixiert. Die
weitere Fixierung mit 1% Osmium Tetroxid in PBS und die Aufnahmen am Laser Scanning
Elektronen Mikroskop wurde am MPI für Entwicklungsbiologie in Tübingen von Jürgen
Berger und Heinz Schwarz durchgeführt.
Ergebnisse 23
4 ERGEBNISSE
Der Ergebnisteil ist in drei Kapitel unterteilt. Im ersten Teil wird auf den Zusammenhang
zwischen Energie-abhängiger Translokation von sekretorischen Proteinen und Transport
der benötigten Energie in das ER Lumen eingegangen (Kochendorfer et al., 1999). Im
zweiten Teil wird nach Faktoren gesucht, die gemeinsam mit SAC1 eine essentielle
zelluläre Funktion haben. Einer dieser isolierten Faktoren und seine gemeinsame Funktion
mit SAC1 wird im dritten Teil beschrieben.
4.1 GENETISCHE INTERAKTIONEN VON SAC1 MIT
KOMPONENTEN DES TRANSLOKATIONS-
APPARATES
ATP wird für die Translokation und Faltung von sekretorischen Proteinen im ER benötigt
(Lyman and Schekman, 1997) und muß daher aus dem Cytosol in das ER Lumen
transportiert werden, woran Sac1p beteiligt ist (Mayinger et al., 1995). Zu Beginn dieser
Arbeit war noch nicht klar, ob Sac1p direkt oder als regulatorischer Faktor an dem ATP-
Transport in das ER Lumen beteiligt ist. In der Zwischenzeit wurde von (Kochendorfer et
al., 1999) gezeigt, daß Sac1p ein regulatorischer Faktor ist. In vitro war gezeigt worden,
daß eine Deletion des SAC1 Gens einen reduzierten ATP-Transport in das ER Lumen und
verlangsamte Reifung von Vorläuferproteinen in Hefe zur Folge hat (Mayinger et al.,
1995). Falls sich diese in vitro Daten auf in vivo Verhältnisse übertragen lassen, sollten
sich genetische Interaktionen zwischen Komponenten des Translokationsapparates und
SAC1 nachweisen lassen. Um diese Annahme zu überprüfen, wurde in der vorliegenden
Arbeit als erstes untersucht, was für Auswirkungen in vivo die Deletion von SAC1 in
sec61, sec62 bzw. sec63 Mutanten auf die Zelle hat.
Ergebnisse 24
Abbildung 3: Gezeigt sind die folgenden Tetradenanalysen: (A) YOO98 x YM1865 (sec61-2 x sac1
∆
). (B)
YOO08 x YM1865 (sec61-3 x sac1
∆
), links und Kontrolle YOO08 x YM1863 (sec61-3 x SAC1) rechts. (C)
RSY529 x YM1864 (sec62-1 x sac1
∆
), links und Kontrolle RSY529 x YM1862 (sec62-1 x SAC1) rechts.
(D) J51-5c x YM1864 (sec63 x sac1
∆
), links und Kontrolle J51-5c x YM1862 (sec63 x SAC1) rechts. Die
Sporen einer Tetrade wurden untereinander abgelegt.
Ergebnisse 25
4.1.1 sac1
∆
sec61ts und sac1
∆
sec63ts, nicht aber sac1
∆
sec62ts sind
synthetisch letal
Hier wurde der direkte genetische Ansatz gewählt, um die Interaktionen von SAC1 mit
SEC61, SEC62 bzw. SEC63 zu untersuchen. Dazu wurden sac1
∆
Stämme (YM1864 und
YM1865) mit den jeweiligen sec61ts, sec62ts und sec63ts (ptl1ts) Stämmen gekreuzt und die
Diploiden anschließend sporuliert. Bei der darauf folgenden Tetradenanalyse sollten im
Falle von synthetisch letalen Interaktionen aus den Sporen der Doppelmutanten keine
Kolonien hochwachsen. Ist die Doppelmutante allerdings lebensfähig, so sollten alle vier
Sporen einer Tetrade hochwachsen. Für die genaue Analyse der Tetraden ist die
chromosomale Lage der untersuchten Gene zueinander und zu den Centromeren wichtig.
Da SAC1, SEC61, SEC62 und SEC63 auf verschiedenen Chromosomen und entfernt von
den jeweiligen Centromeren liegen, segregieren sie bei der Meiose unabhängig
voneinander. Dies sollte sich in dem Verhältnis der drei verschiedenen Tetradentypen
PD:NPD:T (Abb. 2) widerspiegeln, das unter diesen Voraussetzungen 1:1:4 sein sollte
(siehe Einleitung). Falls die Doppelmutation von sac1
∆
mit sec61ts, sec62ts oder sec63ts
letal ist, so sollten diese Sporen nicht hochwachsen. Der sac1
∆
Stamm wurde mit zwei
allelen sec61 Stämmen, einem sec62 und einem sec63 Stamm gekreuzt und anschließend
die Tetradenanalyse durchgeführt. In Abb. 3 (A – D) sind die dissektierten Tetraden abge-
bildet, in Tabelle 7 sind die Ergebnisse der Analyse zusammengefaßt. Die relativ hohe
Anzahl an weniger als
vier lebensfähigen
Sporen einer Tetrade
im Fall von sac1
∆
sec61 und sac1
∆
sec63 im Vergleich zu
der Kontrolle zeigt,
daß diese
Kombinationen
synthetisch letal sind,
während keine
genetische Interaktion
zwischen sac1
∆
und
Anzahl lebensfähiger Sporen
Analysierte
Mutationen
Anzahl
Tetraden 1234
sec61-2 x sac1
∆
26 - 6 17 3
sec61-3 x SAC1 8 ---8
sec61-3 x sac1
∆
27 - 7 13 7
sec62-1 x SAC1 13 - - - 13
sec62-1 x sac1
∆
29 2 - 6 21
sec63 x SAC1 9 ---9
sec63 x sac1
∆
38 7 12 12 7
Tabelle 7: Ergebnisse der Tetradenanalysen. Aus der Anzahl der
lebensfähigen Sporen und deren Verteilung lassen sich synthetisch letale
Interaktionen für SAC1 mit SEC61 bzw. SEC63 ableiten (siehe Text).
Ergebnisse 26
sec62 gezeigt werden konnte. Um aus den dissektierten Tetraden die genaue Verteilung der
Tetradentypen auszurechnen und eine (statistisch fundierte) Aussage zu treffen, hätten
noch mehr Tetraden dissektiert werden müssen.
4.1.1.1 sac1-22 komplementiert den synthetisch letalen Phänotyp von sac1
∆
sec61ts
und sac1
∆
sec63ts
Sac1p spielt sowohl im Phospholipid Metabolismus eine Rolle (Rivas et al., 1999), als
auch im ATP-Transport in das ER (Mayinger et al., 1995). Um zu unterscheiden, welcher
Defekt für die synthetisch letalen Interaktionen von sac1
∆
mit sec61-2 und sec63
verantwortlich ist, wurde das sac1-22 Allel eingesetzt. Wie sac1
∆
Zellen haben sac1-22
Zellen ebenfalls einen Defekt im Phospholipid Metabolismus, zeigen aber Wildtyp ATP-
Transport (Kearns et al., 1997). Die Ausgangsstämme (ATY307, ATY308, ATY311)
waren mit dem Plasmid pAT2 (CEN URA3 SAC1) transformiert worden, um die
synthetische Letalität von sac1
∆
sec61ts und sac1
∆
sec63ts zu supprimieren. Dadurch
waren die Zellen auf Normalmedium lebensfähig und konnten auf 5‘FOA-Platten, die
gegen den URA3 Marker selektieren, getestet werden. Zusätzlich wurden diese Stämme
mit dem Plasmid pAT3 (CEN TRP1 sac1-22) transformiert. Wie in Abb. 4 zu sehen ist,
Abbildung 4: Dargestellt ist das Wachstum verschiedener Hefestämme auf einer Kontrollplatte (YPD) und
einer selektiven Platte (5‘FOA), mit der gegen URA3 Plasmide selektiert wird. Links ist gezeigt, wie die
Stämme aufgetragen wurden. Die Platten wurden fünf Tage bei 25°C inkubiert. Wie zu sehen ist,
komplementiert das sac1-22 Allel den synthetisch letalen Phänotyp von sac1
∆
sec61-2 und sac1
∆
sec63.
Ergebnisse 27
sind die Stämme sac1
∆
sec61-2 und sac1
∆
sec63 nicht ohne das funktionstüchtige SAC1
Gen lebensfähig. Wie ebenfalls in Abb. 4 zu sehen ist, komplementiert sac1-22 den
synthetisch letalen Phänotyp von sac1
∆
sec61-2 und sac1
∆
sec63, woraus geschlossen
werden kann, daß die synthetische Letalität von dem Mangel an ATP im ER verursacht
wird.
4.2 SYNTHETISCH LETALER SCREEN
Sac1p ist an mehreren zellulären Prozessen beteiligt, ATP-Transport in das ER (Mayinger
et al., 1995), Phospholipid Metabolismus (Rivas et al., 1999) und Anordnung des Aktin
Cytoskeletts (Novick et al., 1989). Wie Sac1p den Zusammenhang zwischen den
verschiedenen Funktionen koordiniert, ist nicht bekannt. Neuere Daten deuten auf eine
Funktion als Polyphosphoinositid Phosphatase in Phosphoinositid Signalwegen hin (Guo et
al., 1999). Eine unvoreingenommene Suche nach weiteren interagierenden Faktoren sollte
zur Aufklärung der Funktionen von Sac1p beitragen. Da die Deletion des SAC1 Gens nicht
letal ist, war eine Grundvoraussetzung für die Durchführung eines synthetisch letalen
Screen erfüllt. Wie in der Einleitung beschrieben, können in einem synthetisch letalen
Screen Faktoren identifiziert werden, die oberhalb, unterhalb oder parallel zu einer
Signaltransduktionskaskade, bzw. in diesem Fall zu SAC1, aktiv sind. So sollte es möglich
sein, Komponenten des ATP-Transport Systems des ERs zu identifizieren, wie z. B. den
ATP-Transporter oder weitere regulatorische Proteine desselben. Auch könnten Gene
identifiziert werden, deren Produkte an Phosphoinositid Signalwegen beteiligt sind, oder
die eine Sac1p-abhängige Rolle bezüglich des Aktin Cytoskeletts spielen.
4.2.1 Planung des Screens
Für den Screen wurde zum einen ein centromeres Plasmid (pAT1) benötigt, das das
funktionstüchtige SAC1 Gen und Marker enthält, gegen die selektiert werden kann.
Centromere Plasmide liegen in niedriger Kopienzahl (1-2) in der Zelle vor, pro Generation
verliert ~ 1 % der Zellen diese Plasmide und sie segregieren bei der Meiose wie ein
Chromosom (Ausubel, 1993). Als Selektionsmarker wurden die CAN1 und LYS2 Gene
verwendet. Das CAN1 Gen codiert für die Argininpermease, die Arginin und Canavanin
Ergebnisse 28
aus dem Medium aufnimmt (Adams et al., 1997), wobei Canavanin (Can) ein toxisches
Analog von Arginin ist. Das Genprodukt von LYS2 ist am Lysinstoffwechsel beteiligt, für
den α-Aminoadipinsäure (αAA) ein toxisches Substrat ist (Zaret and Sherman, 1985). Mit
diesen beiden Markern kann auf αAA und Can Platten gegen das Plasmid und für
synthetisch letale Interaktionen mit sac1
∆
nach der EMS Mutagenese selektiert werden.
Zum anderen wurden Ausgangsstämme für den Screen benötigt, die bestimmte
Merkmale aufweisen, damit die Selektion für synthetisch Letale mit sac1
∆
erfolgreich
durchgeführt werden kann. Die Stämme mußten resistent gegen αAA und Canavanin
(canR) sein. Dazu wurde die vorhandene lys2 Mutation ausgenutzt und das CAN1 Gen
deletiert. Unter anderem für das Rückkreuzen der erhaltenen Mutanten mit den
Ausgangsstämmen wurden isogene Stämme beider Paarungstypen benötigt. Daher wurde
nach der CAN1 Deletion der isogene Stamm des anderen Paarungstyps konstruiert.
Außerdem mußte die Deletion von SAC1 in den beiden isogenen Stämmen mit zwei
unterschiedlichen Markern erfolgen, damit diese bei der Selektion für Diploide ausgenutzt
werden können. Dazu wurde in dem MATa Stamm SAC1 mit HIS3 deletiert und in dem
isogenen MAT
α
Stamm wurde SAC1 mit TRP1 deletiert. Zwei weitere Marker waren
vorhanden (ura3, leu2), um Plasmide in die resultierenden Mutanten zu transformieren, z.
B. die genomische Bank zur Identifikation des mutierten Gens.
4.2.1.1 Konstruktion canavaninresistenter (canR) Stämme
Zur Einführung der Canavaninresistenz als Marker für die Selektion nach synthetisch
Letalen mit sac1
∆
, wurde SEY6210 als Ausgangsstamm gewählt, in dem zunächst das
CAN1 Gen deletiert wurde. Dazu wurde, wie in Kapitel 3.2.3.6 beschrieben, verfahren. Mit
den resultierenden Positiven wurden zur Überprüfung PCRs mit ganzen Hefezellen
(Kapitel 3.2.3.8) durchgeführt. In Abb. 5A ist das Agarosegel mit den analytischen PCRs
gezeigt. Wie erwartet, läuft das amplifizierte Wildtyp Fragment bei 1.5 kb, während das
Produkt (can1::hisG:URA3:hisG::can1) direkt nach der Transformation bei 2.1 kb läuft.
Nach der Selektion gegen das URA3 Gen ist das amplifizierte Fragment
(can1::hisG::can1) nur noch 0.5 kb groß. Der resultierende Stamm wurde ATY6211
genannt. In Abb. 5B ist die analytische PCR mit den CAN1-Primern für Stämme ATY6212
und ATY6214 gezeigt. In Abb. 6 ist das Wachstum der Stämme SEY6210, ATY6211,
ATY6213, ATY6215 und ATY6216 auf Platten ohne und mit Canavanin gezeigt. Der
Ausgangsstamm SEY6210 kann nicht wachsen (canS), während die Stämme ATY6211 und
Ergebnisse 29
ATY6213 canR sind, und damit wachsen können. In den Stämmen ATY6215 und
ATY6216 wurde das funktionstüchtige CAN1 Gen auf dem Plasmid wieder eingeführt, so
daß diese wieder canS sind.
Abbildung 5: Analytische PCRs zur Bestätigung der Deletion des CAN1 Gens. Als Primer wurden CAN1-
5‘ und CAN1-3‘ verwendet. (A) 1: SEY6210 (wt), 2: nach Integration des hisG::URA3::hisG Fragments, 3:
ATY6211, nach Selektion gegen URA3 (can1::hisG). (B) Überprüfung der Stämme für den Screen vor der
Transformation mit dem Plasmid mit pAT1. 1: SEY6210 (wt), 2: ATY6212, 3: ATY6214.
Abbildung 6: Die Deletion des CAN1 Gens wurde in vivo auf Platten ohne und mit Canavanin überprüft.
Der Kontrollstamm, SEY6210 (wt) zeigt auf Can Platten kein Wachstum, während die Stämme ATY6211
und ATY6213 durch die Deletion Canavanin Resistenz zeigen. Die Stämme ATY6215 und ATY6216 zeigen
durch das Plasmid pAT1 (CAN1, LYS2, SAC1) wieder Canavanin Sensitivität. Die beiden Stämme wurden
von selektiven Platten (HC-Lys) auf die Can Platten ausgestrichen, damit sie nicht das Plasmid verlieren
können. Links ist dargestellt, wie die Stämme auf den Platten ausgestrichen sind, in der Mitte ist die
Kontrollplatte gezeigt, auf der alle Stämme wachsen können.
Ergebnisse 30
4.2.1.2 Konstruktion isogener Stämme mit unterschiedlichem Paarungstyp
Um zwei isogene Stämme mit unterschiedlichem Paarungstyp zu erhalten, wurde in dem
Stamm ATY6211 in zwei Schritten der MAT
α
Lokus gegen den MATa Lokus ausgetauscht
(siehe Kapitel .3.3.7). In Abb. 7 sind die beiden Platten nach dem Kreuzen mit den
Testerstämmen gezeigt. Es wurde ein MATa Stamm gewählt, der sich mit dem MAT
α
Stamm kreuzen ließ. Dieser Stamm wurde ATY6213 genannt. Damit waren isogene
Stämme mit unterschiedlichem Paarungstyp vorhanden.
Abbildung 7: Kreuzung der veränderten
Stämme mit zwei Testerstämmen zur
Bestimmung des Paarungstyps. 72
isolierte Kolonien wurden auf eine YPD
Platte aufgetragen und mit dem MAT
α
und dem MATa Testerstamm gekreuzt
und über Nacht bei 30°C inkubiert.
Anschließend wurden die zwei Platten auf
selektive Platten replica plattiert. Durch
den Genotyp der Testerstämme können
nur Diploide auf den selektiven Platten
hochwachsen. Dadurch läßt sich der
Paarungstyp eindeutig bestimmen. Links
können nur MATa Stämme wachsen,
während rechts nur MAT
α
Stämme
Wachstum zeigen.
4.2.1.3 Konstruktion der sac1::HIS3 und sac1::TRP1 Stämme
Für die Deletion des SAC1 Gens wurde entweder der HIS3 oder TRP1 Marker eingesetzt
(siehe Kapitel 3.2.3.5). Mit analytischen Primern (SAC1-3in2 und SAC1-5in), die an die
flankierenden Sequenzen der veränderten Region anlagern, wurden die Deletionen mittels
PCR überprüft. Während beim Wildtyp ein Fragment von 0.9 kb amplifiziert wurde, wurde
im Fall von sac1::TRP1 ein Fragment von 1.4 kb, und im Fall von sac1::HIS3 ein
Fragment von 1.6 kb amplifiziert. Wie in Abb. 8A gezeigt, wurde im Stamm ATY6211 das
SAC1 Gen erfolgreich mit TRP1 deletiert und der resultierende Stamm wurde ATY6212
genannt. Wie in Abb. 8B gezeigt, wurde im Stamm ATY6213 das SAC1 Gen erfolgreich
mit HIS3 deletiert und der resultierende Stamm wurde ATY6214 genannt.
Ergebnisse 31
Abbildung 8: Gezeigt ist die PCR Analyse
zweier sac1 Mutanten. Als Primer wurden
SAC1-3in2 und SAC1-5in verwendet. (A)
Deletion von SAC1 mit dem TRP1 Marker. 1:
ATY6212 (sac1::TRP1), 2: ATY6211 (wt).
(B) Deletion von SAC1 mit dem HIS3
Marker. 1: ATY6214 (sac1::HIS3), 2:
ATY6213 (wt).
4.2.1.4 Konstruktion des Plasmids pAT1
Für die Selektion der synthetisch Letalen mit sac1
∆
sollten die funktionstüchtigen CAN1,
LYS2 und SAC1 Gene Bestandteile des centromeren Plasmids sein. Das Schema in Abb. 9
zeigt das Prinzip, nach dem pAT1 hergestellt wurde (siehe auch Kapitel 3.1.2). In Abb.
10A sind die Produkte aus der PCR zur Herstellung des 9.5 kb LYS2/CAN1 Fragments
dargestellt. Es wurden drei PCRs mit verschiedenen Konzentrationen an Polymerase
angesetzt. In allen Reaktionen wurde ein Produkt gleicher Größe amplifiziert, die Ausbeute
bei der Verwendung von 2 Einheiten Polymerase war am höchsten. In Abb. 10B wurde
pAT2 zuerst mit AatII (8.0 kb) und anschließend mit NsiI (6.9 kb + 1.1 kb) verdaut und auf
das Gel aufgetragen. Das 1.1 kb Fragment des herausgeschnittenen URA3 Markers ist
dabei nicht mehr zu erkennen. Nach der Herstellung der beiden linearen Fragmente wurden
diese zusammen in Hefezellen transformiert und auf HC-Lys Platten für das durch
homologe Rekombination entstandene zirkuläre Plasmid selektiert. Dieses wurde dann aus
den Hefezellen isoliert, in E. coli amplifiziert und dann analysiert. In Abb. 10C ist das
Plasmid pAT1 vor (zirkulär) und nach (linear) dem Restriktionsverdau mit SacI zu sehen.
Das Plasmid pAT1 wurde in die Stämme ATY6212 und ATY6214 transformiert. Die
resultierenden Stämme wurden ATY6215 und ATY6216 genannt und auf Can Platten
(Abb. 6) und auf Inositol-freien Platten (Abb. 11) getestet. Die Stämme sind canS, nicht
mehr inositolauxotroph und für das Plasmid wurde auf HC-Lys Platten selektiert. Aus
diesen Ergebnissen wurde geschlossen, daß alle drei Gene (CAN1, SAC1 und LYS2)
funktionstüchtig sind.
Ergebnisse 32
Abbildung 9: Schema der Konstruktion von pAT1, dem Plasmid für den Screen. Als Ausgangsvektor
wurde pAT2 verwendet, aus dem der URA3 Marker entfernt wurde. Um die CAN1 und LYS2 Marker in das
Plasmid zu integrieren, wurden zwei Primer konstruiert, deren Enden (rot) homolog zu den freien Enden des
geschnittenen Plasmids (rot) waren und mit denen die Marker mit Hilfe des pBKS-Plasmids amplifiziert
wurden. Durch Transformation der beiden linearen Fragmente in Hefe entstand das zirkuläre Plasmid pAT1.
Ergebnisse 33
Abbildung 10: Gezeigt sind die Agarosegele der verschiedenen
Fragmente zur Konstruktion von pAT1. (A) Agarosegel nach der
Amplifikation der CAN1 und LYS2 Marker mit den Primern prAT1 und
prAT2. X: Boehringer DNA-Standard, 1: 2,5 U TaKaRa/100 µl Reaktion,
2: 2,0 U TaKaRa/100 µl Reaktion, 3: 1,5 U TaKaRa/100 µl Reaktion. (B)
Herausschneiden des URA3 Markers aus pAT2 mit AatII und NsiI. 1:
pAT2 linearisiert mit AatII, 2 und 3: pAT2 nach Verdau mit AatII und
NsiI, 1,1 kb wurden herausgeschnitten (URA3). (C) Analyse des fertigen
Plasmids pAT1. Spuren 1, 2, 3: Das Plasmid wurde mit SacI linearisiert.
Spuren 1‘, 2‘ 3‘: Das zirkuläre Plasmid.
Abbildung 11: Die Hefestämme für den Screen wurden auf einer Kontrollplatte (Mitte) und einer Inositol-
freien Platte (rechts) nach dem Schema auf der linken Seite aufgetragen. SEY6210 (wt) zeigt Wachstum, die
beiden sac1
∆
Stämme (ATY6212 und ATY6214) zeigen kein Wachstum, und diese beiden Stämme mit dem
Plasmid pAT1 (ATY6215 und ATY6216) zeigen wieder Wachstum auf den Inositol-freien Platten. In vivo
wurde damit bestätigt, daß pAT1 (SAC1) die Inositolauxotrophie von sac1
∆
komplementieren kann.
Ergebnisse 34
Abbildung 12: Schematische
Darstellung der Durchführung des
synthetisch letalen Screens.
4.2.2 Durchführung des Screens
In Abb. 12 ist schematisch die Durchführung des Screens aufgezeigt. Jeweils eine
Übernachtkultur der Stämme ATY6215 und ATY6216 wurde mit EMS
(Ethylmethansulfonat) mutagenisiert (siehe Kapitel 3.2.3.9) und anschließend auf YPD
Platten hochgezogen. Durch Vergleich mit der nicht-mutagenisierten Kontrolle ergab sich
eine Überlebensrate von ~ 15%. Insgesamt wuchsen ~ 32000 mutagenisierte Kolonien
hoch. Diese wurden auf Can und YPD Platten replica plattiert, um gegen das Plasmid
pAT1 (CAN1 LYS2 SAC1) zu selektieren. Nach Vergleich der Can Platten mit den
dazugehörigen YPD Platten wurden nach fünf Tagen 594 Kolonien ausgewählt, die nicht
oder schlecht auf den Can Platten wuchsen. Diese wurden von den YPD Platten genommen
und auf frische YPD Platten ausgestrichen. Die hochgewachsenen Zellen wurden je auf
eine Can, αAA und YPD Platte gestempelt. Nach fünf Tagen Inkubation bei 25°C wurden
95 Stämme ausgewählt, die weder auf Can noch auf αAA Platten aber auf YPD Platten
Ergebnisse 35
wachsen konnten. Diese Stämme wurden mit den Ausgangsstämmen ATY6215 bzw.
ATY6216 (je nach Paarungstyp) gekreuzt (→ Rückkreuzen). Durch das Rückkreuzen
sollte ausgeschlossen werden, daß die synthetisch letalen Interaktionen mit sac1
∆
von
Mutationen in mehr als einem Gen verursacht werden. Die Diploiden wurden auf HC-Trp-
His Platten selektiert. Zum einen wurde auf Can und αAA Platten getestet, ob die jeweilige
Mutation dominant oder rezessiv war. Alle Diploiden wuchsen auf Can Platten hoch, und
somit waren alle Mutationen rezessiv. Zum anderen wurden die Diploiden sporuliert und
die Tetraden dissektiert. Die hochgewachsenen Sporen wurden von der YPD Platte auf
Can, HC-Trp und HC-His Platten replica plattiert. Außerdem wurden sie auf Platten mit
MATa und MAT
α
Testerstämmen replica plattiert, um den Paarungstyp zu bestimmen. Von
69 Mutanten wurde je eine Spore ausgewählt, die aus einer vollständigen Tetrade stammte.
Eine Tetrade war dann vollständig, wenn die Verteilung der genetischen Marker wie folgt
aussah. Zwei Sporen mußten sac1::HIS3 sein, die anderen zwei sac1::TRP1; zwei Sporen
mußten MATa, die anderen zwei MAT
α
sein; und den synthetisch letalen Phänotyp
mußten zwei der vier Sporen zeigen. Für das weitere Rückkreuzen wurde nun auch der
Stamm ATY6219 (MATa sac1::TRP1) eingesetzt, damit die Diploiden weiterhin auf HC-
Trp-His Platten selektiert werden konnten. Nach der zweiten Runde Rückkreuzen trafen
diese Kriterien noch auf 57 Stämme zu und nach der dritten Runde auf 38 Stämme. Diese
Stämme wurden alle mit dem Plasmid pAT2 (SAC1 URA3) transformiert. Mit diesem
Plasmid sollten die Stämme wieder auf Can und αAA Platten wachsen, da die Zellen nun
nicht mehr von pAT1 abhängig waren und es verlieren konnten. Wurden die Stämme aber
von Can Platten anschließend auf 5‘FOA Platten ausgestrichen, sollten sie kein Wachstum
mehr zeigen. Dieser Test wurde für alle Mutanten mit und ohne pAT2 durchgeführt. Nach
der Auswertung wurde die Anzahl der Positiven auf 17 reduziert. Die erhaltenen Mutanten
wurden lsa genannt („letal mit sac1
∆
“).
gescreente Kolonien: ~ 32000
Überlebensrate: ~ 15%
Positive nach Can Selektion: 594
Positive nach αAA Selektion: 95
Positive nach 1. Rückkreuzen: 69
Positive nach 2. Rückkreuzen: 57
Positive nach 3. Rückkreuzen: 38
Positive nach 5‘FOA Selektion mit pAT2: 17
Komplementationsgruppen: 12
Tabelle 8: Statistik des Screens.
Ergebnisse 36
4.2.3 Charakterisierung der erhaltenen Mutanten
Wie oben schon beschrieben, waren alle erhaltenen Mutationen rezessiv. Um Aufschluß
über die Anzahl der erhaltenen Gene zu bekommen, wurden die Komplementations-
gruppen bestimmt, indem jede Mutante mit jeder anderen gekreuzt wurde. Dazu wurden je
~ 10 µl von zwei Übernachtkulturen unterschiedlichen Paarungstyps auf einer YPD Platte
gemischt, bei 30°C inkubiert, und nach ~ 4 h wurde unter dem Mikroskop die Bildung von
Zygoten beobachtet. War dies der Fall wurden die entstandenen diploiden Zellen weiter
über Nacht bei 30°C inkubiert und dann auf Can Platten auf ihr Wachstum untersucht.
Waren die Mutationen verschiedene Allele des selben Gens, dann war kein Wachstum auf
Can Platten sichtbar. Es wurde eine Komplementationsgruppe mit vier Allelen (lsa1-1 bis
lsa1-4), eine Komplementationsgruppe mit drei Allelen (lsa2-1 bis lsa2-3) und 10 weitere
Komplementationsgruppen mit je einem Allel (lsa3-1 bis lsa12-1) gefunden (Tabelle 9).
Weiter wurde getestet, ob die Stämme bei 14°C, 30°C und 37°C wachsen können. Zwei
Stämme (lsa1-3 und lsa4-1) zeigten einen kältesensitiven Phänotyp, vier Stämme zeigten
einen thermosensitiven Phänotyp (lsa1-1, lsa2-1, lsa5-1 und lsa8-1) und lsa1-4 zeigte
kälte- und thermosensitives Verhalten (Tabelle 9).
Name # Phänotyp sac1-22
Komplementation
CFW sens
0.02 mg/ml CFW
lsa1-1 286 ts nein ja
lsa1-2 455 nein nein
lsa1-3 486 cs ja nein
lsa1-4 519 ts und cs ja ja
lsa2-1 25 ts ja ja
lsa2-2 125 ja ja
lsa2-3 573 nein nein
lsa3-1 135 nein ja
lsa4-1 242 cs ja nein
lsa5-1 349 ts ja ja
lsa6-1 353 nein nein
lsa7-1 397 nein nein
lsa8-1 452 ts nein ja
lsa9-1 476 ja nein
lsa10-1 485 nein nein
lsa11-1 537 nein nein
lsa12-1 591 ja nein
Tabelle 9: Zusammenfassung der ersten phänotypischen Charakterisierung der
isolierten Mutanten.
Ergebnisse 37
4.2.3.1 Die Mutanten lassen sich in verschiedene Gruppen bezüglich des ATP-
Transports einteilen
Wie schon in Kapitel 4.1.1.1 beschrieben, wurde auch hier wieder das sac1-22 Allel
genutzt (Kearns et al., 1997), um die Mutanten in zwei Obergruppen bezüglich des ATP-
Transports einzuteilen (Tabelle 9). Entweder war die Komplementation mit dem Wildtyp
ATP-Transport ausreichend oder es wurde zusätzlich die Komplementation anderer
Funktionen von Sac1p benötigt. Alle Mutanten wurden deshalb mit dem Plasmid pAT3
(sac1-22 TRP1) transformiert. Die Zellen (mit und ohne pAT3) wurden auf YPD, Can und
αAA Platten ausgestrichen. Bei acht Stämmen (lsa1-3, lsa1-4, lsa2-1, lsa2-2, lsa4-1, lsa5-
1, lsa9-1 und lsa12-1) konnte der synthetisch letale Phänotyp von sac1-22 komplementiert
werden, bei den anderen neun nicht (lsa1-1, lsa1-2, lsa2-3, lsa3-1, lsa6-1, lsa7-1, lsa8-1,
lsa10-1 und lsa11-1). Wie in Tabelle 9 zu sehen, war die Komplementation nicht allel-
spezifisch für jede Komplementationsgruppe.
Um eine Aussage treffen zu können, ob eine spezielle Mutante am ATP-Transport
in das ER beteiligt sein könnte, wurde von allen Stämmen Mikrosomen präpariert und der
ATP-Transport gemessen. Aus den Transportexperimenten lassen sich zwei Parameter
bestimmen. Zum einen die Menge an aufgenommenem ATP oder Kapazität des Transports
(Abb. 13) und zum anderem die Aufnahmerate (Abb. 14). Die Kapazität des Transports
wird beeinflußt durch das Volumen der Mikrosomen, während die Aufnahmerate von der
relativen Anzahl der Transporter in der Membran und deren Aktivität abhängig ist. Als
Wildtyp-Kontrolle wurden ATY6215 und ATY6216 eingesetzt. Bei je acht Stämmen war
die Kapazität höher (lsa1-1, lsa1-3, lsa2-2, lsa5-1, lsa8-1, lsa10-1, lsa11-1 und lsa12-1)
bzw. niedriger (lsa1-2, lsa1-4, lsa2-1, lsa2-3, lsa3-1, lsa4-1, lsa6-1 und lsa7-1) und bei
einem Stamm (lsa9-1) entsprach sie dem Wildtyp. Diese Ergebnisse lassen sich in keine
Korrelation mit den Komplementationsgruppen oder den Ergebnissen aus der
Komplementation mit sac1-22 bringen.
Da die Kapazität des ATP-Transports nur die Eigenschaften der Mikrosomen
widerspiegelt, also von deren Volumen abhängig ist, aber nichts über die Aktivität des
Transporters aussagt, wurde außerdem die Geschwindigkeitskonstante des Transports aus
den Meßwerten für 20, 40 und 70 Sekunden bestimmt. Es wurde angenommen, daß der
ATP-Transport als Reaktion erster Ordnung abläuft. Bei halblogarithmischer Auftragung
ergibt die Steigung der resultierenden Geraden die Ratenkonstante (kcat) des Transports an
(Kramer and Klingenberg, 1977). Meist entsprach sie dem Wildtyp; bei lsa2-1, lsa2-2,
Ergebnisse 38
lsa3-1, lsa5-1 und lsa12-1 verlief der Transport langsamer (Abb. 14) und bei lsa1-2 und
lsa2-3 konnte die Kinetik nicht bestimmt werden.
Die oben in zwei Gruppen eingeteilten Stämme wurden weiter anhand der gerade
beschriebenen ATP-Transportrate unterteilt:
› Bei den Stämmen lsa2-1, lsa2-2, lsa5-1 und lsa12-1 komplementiert sac1-22
den synthetisch letalen Phänotyp und die ATP-Transportrate ist verlangsamt.
› Bei den Stämmen lsa1-3, lsa1-4, lsa4-1 und lsa9-1 komplementiert sac1-22 den
synthetisch letalen Phänotyp und die ATP-Transportrate entspricht Wildtyp.
› Bei den Stämmen lsa1-1, lsa6-1, lsa7-1, lsa8-1, lsa10-1 und lsa11-1
komplementiert sac1-22 nicht den synthetisch letalen Phänotyp und die ATP-
Transportrate entspricht Wildtyp.
› Der Stamm lsa3-1 bildet alleine die Gruppe, in der das sac1-22 Allel nicht den
synthetische letalen Phänotyp komplementiert und die ATP-Transportrate
verlangsamt ist.
Wie in Kapitel 4.1 gezeigt wurde, sind die Doppelmutationen von sac1
∆
und sec61
ts
bzw.
sec63
ts
synthetisch letal, und das sac1-22 Allel komplementiert die synthetische Letalität.
Daher wurden alle isolierten Stämme, bei denen mit dem sac1-22 Allel komplementiert
werden konnte (lsa1-3, lsa1-4, lsa2-1, lsa2-2, lsa4-1, lsa5-1, lsa9-1 und lsa12-1), mit dem
sac1
∆
sec61-3
ts
(ATY309) Stamm bzw. dem sac1
∆
sec63
ts
(ATY311-1) Stamm gekreuzt.
Die resultierenden Diploiden zeigten alle auf Can, αAA und 5‘FOA Platten Wachstum
(Daten nicht gezeigt). Daraus wurde geschlossen, daß in dem Screen kein Allel von SEC61
oder SEC63 gefunden wurde.
Ergebnisse 39
Ergebnisse 40
Ergebnisse 41
Abbildung 13: Dargestellt ist die Kinetik des
mikrosomalen ATP-Transports der aus dem Screen
isolierten Stämme. Die durchgezogene Kurve entspricht der
Wildtyp Kontrolle und wurde den quadratischen
Datenpunkten logarithmisch angepaßt, während die
gestrichelte Kurve den rautenförmigen Datenpunkten
logarithmisch angepaßt wurde und zu der jeweiligen
Mutante gehört.
Abbildung 13: Dargestellt ist die Kinetik des
mikrosomalen ATP-Transports der aus dem Screen
isolierten Stämme. Die durchgezogene Kurve entspricht der
Wildtyp Kontrolle und wurde den quadratischen
Datenpunkten logarithmisch angepaßt, während die
gestrichelte Kurve den rautenförmigen Datenpunkten
logarithmisch angepaßt wurde und zu der jeweiligen
Mutante gehört.
Ergebnisse 42
Abbildung 14: Die Rate des ATP-Transports in das ER wurde
halblogarithmisch gegen die Zeit aufgetragen. Dargestellt sind nur die
vom Wildtyp abweichenden Raten. Nach der Gleichung kt = -
ln[A0/(A0-At)] wurde -ln[A0/(A0-At)] gegen die Zeit t aufgetragen,
wobei At die transportierte Menge an ATP zum Zeitpunkt t und A0 die
gesamte transportierbare Menge an ATP darstellt. Die A0-Werte
wurden extrapoliert und zur Berechnung von -ln[A0/(A0-At)]
verwendet.
Ergebnisse 43
4.2.4 Identifikation von lsa3-1 durch Komplementation mit einer
chromosomalen Genbank
Als erstes zu identifizierendes Gen wurde das lsa3-1 Allel ausgesucht. Es ist der einzige
Stamm, der erniedrigten (Abb. 13) und verlangsamten (Abb. 14) ATP-Transport zeigt und
in dem die synthetische Letalität nicht durch das sac1-22 Allel komplementiert wird
(Tabelle 9). Dies deutet auf eine regulatorische Funktion von LSA3 in Bezug auf den ATP-
Transport in das ER. Die chromosomale Hefebank von (Rose et al., 1987) wurde für die
Identifikation von dem LSA3 Gen, in dem die Mutation durch das EMS eingeführt wurde,
verwendet. Die Bank basiert auf dem centromeren YCp50 Vektor, der mit BamHI
geschnitten wurde und in den die chromosomale DNA, die partiell mit SauIIIA geschnitten
worden war, ligiert wurde (BamHI und SauIIIA erzeugen kompatible Enden). Die Größe
der hineinligierten Fragmente wurde mit 10 bis 15 kb angegeben und die Anzahl der
benötigten unabhängigen Transformanten, um das Genom zu 99.9% abzudecken, mit 8900.
4.2.4.1 Zwei unterschiedliche genomische Fragmente komplementieren lsa3-1 sac1
∆
Der lsa3-1 Stamm wurde mit 1.6 µg der chromosomalen Hefebank transformiert und auf
HC-Ura Platten ausplattiert. Es wuchsen ~ 12000 unabhängige Kolonien hoch. Diese
wurden auf Can Platten replica plattiert und bei Raumtemperatur inkubiert. Mit den auf
Can Platten hochgewachsenen Kolonien wurde weitergearbeitet und nochmals auf Can und
αAA Platten gestempelt. Wurde auf beiden Platten Wachstum beobachtet (also Verlust des
pAT1 Plasmids und Komplementation durch ein genomisches Fragment), wurden diese
Stämme auf 5‘FOA Platten gestempelt, worauf sie kein Wachstum zeigen sollten. Zwei
Kolonien erfüllten diese Voraussetzungen. Da auch SAC1 in der chromosomalen Hefebank
vertreten war, wurde direkt mit den Hefezellen, die auf Can und αAA Platten wuchsen,
eine PCR durchgeführt, bei der die Primer SAC1-3in2 und SAC1-5in eingesetzt wurden.
War SAC1 isoliert worden, so konnte ein Fragment von 0.9 kb amplifiziert werden. Dies
war der Fall für eins der beiden Plasmide. Aus dem anderen Stamm wurde das Plasmid,
welches nicht SAC1 enthielt, isoliert und nochmals zurück in den ursprünglichen lsa3-1
Stamm transformiert. Es wurde getestet, ob das Plasmid noch immer den synthetisch
letalen Phänotyp komplementieren kann. Dies traf zu, und das isolierte Plasmid wurde
p135-1 genannt und weiter charakterisiert.
Ergebnisse 44
4.2.4.2 Ein Abschnitt von Chromosom VIII komplementiert lsa3-1
Das gesamte Genom der Hefe Saccharomyces cerevisiae ist sequenziert und auf
Datenbanken1 verfügbar. Daher wurden zwei Primer hergestellt, die vor und nach der
BamHI Schnittstelle im Vektor YCp50 anlagern (siehe oben). Da die chromosomale Bank
in die BamHI Schnittstelle kloniert wurde, konnte mit diesen Primern das 5‘ und 3‘ Ende
des chromosomalen Fragments ansequenziert werden. Mit diesen beiden Sequenzen konnte
die chromosomale Herkunft und die Anzahl der ORFs auf diesem Fragment genau
bestimmt werden. Die Sequenzierung des komplementierenden Plasmids von lsa3-1 ergab
ein Fragment von Chromosom VIII, das von 164481 bp bis 174402 bp reicht. (Abb. 15).
Diese Region enthält vier ORFs, von denen drei für bekannte Proteine codieren (DAP2,
SLT2 und RTT104) und einer unbekannt ist (YHR029C). DAP2 codiert für die Dipeptidyl
Aminopeptidase B, einem integralen glycosylierten Membranprotein der Vakuole (Roberts
et al., 1989), das an der Proteindegradation in der Vakuole beteiligt ist. RTT104 codiert für
ein nicht weiter charakterisiertes Protein. Rtt104p hat Ähnlichkeiten (37%) mit Pif1p,
einem mitochondrialen DNA Reparatur- und Rekombinationsprotein. Durch
Sequenzhomologien wurden dem Protein Funktionen als Hydrolase, Helikase, ATPase und
DNA-bindendes Protein vorhergesagt2. Die Proteinsequenz des offenen Leserahmens
YHR029C zeigt im N-Terminus leichte Ähnlichkeit zu einer möglichen Thymidylat
Synthase3. Der wahrscheinlichste Kandidat für synthetisch letale Interaktionen mit sac1
∆
,
scheint eine Mutation in SLT2, auch MPK1 genannt, zu sein. SLT2 codiert für ein Homolog
der MAP Kinase Familie. SLT2 Mutanten zeigen einen Defekt in der Zellwandstruktur, der
sich unter anderem in der Lyse der Zellen äußert (Martin et al., 1993). Außerdem zeigen
die Mutanten delokalisiertes Aktin und Chitin, Bestandteile des Cytoskeletts und der
Zellwand (Mazzoni et al., 1993). Auch von sac1 Mutanten ist bekannt, daß Aktin und
Chitin bei der nichtpermissiven Temperatur (14°C) delokalisiert ist (Novick et al., 1989).
Anhand dieser Fakten wurde vermutet, daß sac1
∆
und ein Allel von SLT2 die synthetisch
letalen Interaktionen verursachen. Die anschließenden Analysen wurden daher zunächst
auf SLT2 ausgerichtet.
1 Hefedatenbank: http://genome-www.stanford.edu/Saccharomyces/
2 Hefedatenbank: http://www.proteome.com/databases/YPD/reports/RTT104.html
3 Hefedatenbank: http://www.proteome.com/databases/YPD/reports/YHR029C.html
Ergebnisse 45
Abbildung 15: Zwischen den gestrichelten Linien ist das chromosomale Fragment dargestellt, das den
synthetisch letalen Phänotyp von sac1
∆
las3-1 komplementiert. Es enthält vier komplette ORFs von
Chromosom VIII, die für drei bekannte Proteine und ein unbekanntes codieren. Das Plasmid wurde p135-1
genannt.
4.2.4.3 lsa3-1 hat einen Zellwanddefekt
Von slt2 Mutanten ist in (Martin et al., 1993) beschrieben, daß sie einen Zellwanddefekt
haben. Um zu testen, ob auch lsa3 Mutanten einen Zellwanddefekt aufweisen, wurde die
Sensitivität zu Calcofluor Weiß (CFW) getestet. CFW Sensitivität ist ein Indikator für
Zellwanddefekte. Der Farbstoff CFW blockiert die Polymerisation von Chitin, wodurch die
Zellwand geschwächt wird (Madden et al., 1997), (Igual et al., 1996), (Ram et al., 1994).
Daher wurde der lsa3-1 Stamm und anschließend alle anderen Mutanten auf YPD Platten
mit 0.02 mg/ml CFW ausgestrichen und das Wachstum verglichen (Daten nicht gezeigt).
Der lsa3-1 Stamm konnte auf diesen Platten nicht wachsen, genauso wie sechs weitere
Stämme (lsa1-1, lsa1-4, lsa2-1, lsa2-2, lsa5-1 und lsa8-1; Tabelle 9). Dies deutet darauf
hin, daß diese Stämme einen Zellwanddefekt haben. Der Zellwanddefekt von lsa3-1 ist
konsistent mit der Vermutung, daß lsa3-1 ein Allel von SLT2 ist.
4.2.5 lsa3-1 ist ein Allel von SLT2
Wenn lsa3-1 ein Allel von SLT2 ist, dann muß eine funktionstüchtige Kopie von SLT2 auf
einem Plasmid den synthetisch letalen Phänotyp von sac1
∆
lsa3-1 komplementieren. Dazu
wurde der lsa3-1 Stamm mit dem Plasmid YEp352::MPK1 (M. Hall, Biozentrum, Basel)
transformiert und anschließend auf Can und αAA Platten getestet. Während der Stamm
ohne Plasmid kein Wachstum zeigte, konnte das Plasmid den synthetisch letalen Phänotyp
von lsa3-1 sac1
∆
komplementieren, wodurch die Zellen wachsen konnten (Daten nicht
gezeigt). Das verwendete Plasmid lag in hoher Kopienzahl vor (2µ), wodurch SLT2 auch
Ergebnisse 46
ein Suppressor des letalen Phänotyps von lsa3-1 sac1
∆
sein könnte. Daher wurde SLT2 für
einen weiteren Komplementationstest auf ein centromeres (pAT5, URA3) Plasmid
subkloniert und in den lsa3-1 Stamm transformiert. Mit diesem Stamm wurde die
Komplementation auf αAA Platten getestet. Wie in Abb. 16 zu sehen ist, zeigt der lsa3-1
Stamm mit dem aus der Genbank isolierten Plasmid und mit pAT5 Wachstum, das mit
dem Wildtyp vergleichbar ist.
Abbildung 16: Der synthetisch letale Phänotyp des lsa3-1 Allels mit sac1
∆
wird durch das Gen der MAP
Kinase Slt2p komplementiert. Eine Verdünnungsreihe der jeweiligen Stämme ist auf eine Kontrollplatte links
und eine αAA Platte, die gegen das Plasmid pAT1 selektiert, aufgetragen. pAT1: CEN, SAC1, LYS2, CAN1.
p135-1: Komplementierendes Plasmid, das aus der Hefebank isoliert wurde. pSLT2: pAT5 (CEN, SLT2,
URA3). lsa3-1::SLT2: pAT4 (SLT2, URA3) integriert in das Chromosom des lsa3-1 Stammes an den SLT2
Lokus. Auf αAA Platte zeigt der lsa3-1 Stamm einen starken Wachstumsdefekt, den die Plasmide p135-1,
pSLT2 und das integrierte pAT4 komplementieren, gezeigt durch wiederhergestelltes Wachstum auf
der αAA Platte. Die Anfangskonzentration der zu stempelnden Zellen betrug 107 Zellen/ml. In der
Verdünnungsreihe wurde jeweils 1:5 verdünnt.
Um zu unterscheiden, ob lsa3-1 ein Allel von SLT2 ist oder ein Suppressor, der in
niedriger Kopienzahl ausreichend ist, wurde SLT2 auf ein integratives (pAT4, URA3)
Plasmid subkloniert. Das Plasmid wurde mit PflMI verdaut, transformiert und damit an den
SLT2 Lokus im lsa3-1 Stamm integriert (lsa3-1::SLT2). Damit liegen in dem lsa3-1
Stamm am SLT2 Lokus zwei Kopien von SLT2, getrennt durch den URA3 Marker, vor.
Wie in Abb. 16 zu sehen ist, komplementiert auch das integrierte pAT4 den synthetisch
letalen Phänotyp von lsa3-1 sac1
∆
. Dieser lsa3-1::SLT2 (MAT
α
) Stamm wurde mit dem
lsa3-1 (MATa) Stamm gekreuzt und die Tetradenanalyse durchgeführt. Die erhaltenen
Sporen wurden auf YPD, HC-Ura und CFW Platten gestempelt. Damit wurde hier die
CFW Sensitivität des lsa3-1 Stammes ausgenutzt, die schneller und leichter zu analysieren
war, als die Can oder αAA Sensitivität. Abb. 17 zeigt sechs unabhängige Tetraden.
Ergebnisse 47
Insgesamt wurden 12 Tetraden analysiert. Immer zwei der hochgewachsenen Sporen aus
einer Tetrade sind Ura+ und die gleichen Sporen können auch auf CFW Platten wachsen,
das heißt, der CFW sensitive Phänotyp wird komplementiert. Dementsprechend sind die
anderen zwei Sporen einer Tetrade Ura- und können nicht auf CFW wachsen. Da für alle
12 Tetraden eine Cosegregation von Ura+ mit dem CFW resistenten Phänotyp beobachtet
wurde, kann daraus geschlossen werden, daß der URA3 Marker und das integrierte SLT2
am gleichen Lokus wie lsa3-1 sind, und damit lsa3-1 ein Allel von SLT2 ist.
Abbildung 17: Durch Auftragen der Tetraden auf Uracil-freien und CFW Platten wurde getestet, ob der
LSA3 Lokus mit dem SLT2 Lokus gekoppelt ist. Der Stamm lsa3-1 MATa wurde mit dem Stamm lsa3-
1::SLT2 MAT
α
gekreuzt. Die dissektierten Tetraden wurden auf YPD hochgezogen und dann auf YPD, HC-
Ura und CFW Platten gestempelt. Da das linearisierte Plasmid pAT4 (SLT2, URA3) mit PflMI in der
codierenden Region von SLT2 geschnitten wurde, fand die Integration im lsa3-1 Stamm am SLT2 Lokus
statt. Der URA3 Marker ist daher an das SLT2 Gen gekoppelt. Je zwei der hochgewachsenen Sporen sind
Ura+ und CFW resistent, d. h. zeigen nicht mehr den synthetisch letalen Phänotyp. Da der URA3 Marker und
die Komplementation durch das SLT2 Gen zusammen segregieren, wurde geschlossen, daß lsa3-1 ein Allel
von SLT2 ist.
4.2.5.1 Die lsa3-1 Mutation liegt im aktive Zentrum der Kinase
Es wurden fünf unabhängige Kulturen von lsa3-1 über Nacht bei 30°C angezogen, um
jeweils die genomische DNA zu präparieren. Je 1 µl dieser DNA wurde als Vorlage in die
PCR eingesetzt, als Primer wurden SLT2-A und SLT2-E verwendet. Die Produkte (~ 1.7
kb) wurden aufgereinigt und mit den Primern SLT2-A, MPK1-1, MPK1-2, MPK1-3,
SLT2-E zum Sequenzieren gegeben. Durch Sequenzvergleich wurde festgestellt, daß sich
an Position 457 der codierenden Region statt Guanin Adenin befindet (G457 → A457).
Dadurch ändert sich auch die Proteinsequenz, Asparaginsäure (D153) wird durch Asparagin
(N153) ersetzt. Das Allel lsa3-1 wurde daher in slt2-153N umbenannt. In (Hanks et al.,
1988) wurde die Sequenz der cAMP-abhängigen Protein Kinase (cAPK, Proteinkinase A,
Ergebnisse 48
PKA) mit Sequenzen weiterer Proteinkinasen verglichen. Die im slt2-153N Allel mutierte
Asparaginsäure ist in allen verglichenen Proteinkinasen vorhanden (Abb. 18) und agiert als
katalytische Base der Phosphat-Transfer-Reaktion (Taylor et al., 1993). Durch die
Röntgenstrukturanalyse der Proteinkinase A zeigte sich, daß die Rückgrat-Carbonylgruppe
der Asparaginsäure an der Bildung von Wasserstoffbrücken zur Stabilisierung der
räumlichen Struktur für die Bindung von MgATP beteiligt ist. Wird die Asparaginsäure
166 in cAPK gegen Alanin ausgetauscht, so sinkt die Aktivität auf 0.4%, kcat ist 350-370-
fach niedriger, und KM ist 1.5-fach erhöht (Taylor et al., 1993) (Bossemeyer et al., 1993).
Schwein Pka 162 VLHRDLKP 169
Ratte Erk2 143 VLHRDLKP 150
Maus p38 146 IIHRDLKP 153
Hefe Cdc28 131 ILHRDLKP 138
Hefe Hog1 139 VIHRDLKP 146
Hefe Slt2 149 VLHRDLKP 156
slt2-153N 149 VLHRNLKP 156
Abbildung 18: Dargestellt ist die hochkonservierte Region
in Proteinkinasen um das katalytische Zentrum. Die
Asparaginsäure ist die katalytische Base für die Phosphat-
Transfer Reaktion.
4.2.5.2 Die anderen Mutanten lassen sich nicht durch die Überexpression von SLT2
komplementieren
Da SLT2 Bestandteil einer MAP Kinase Kaskade ist, wäre es möglich, daß noch andere
Faktoren dieser Kaskade mit SAC1 interagieren. Oft kann durch die Überexpression eines
Proteins die Mutation in einem anderen, das oberhalb in der Kaskade agiert, supprimiert
werden. Alle isolierten Stämme wurden daher mit dem Plasmid YEp352::MPK1
transformiert und auf Can und αAA Platten auf Komplementation untersucht. Bei keinem
dieser Stämme konnte das Wachstum auf Can und αAA Platten wiederhergestellt werden
(Daten nicht gezeigt). Daraus wurde geschlossen, daß wahrscheinlich kein weiterer Faktor
dieses MAP Kinase Weges in dem Screen gefunden wurde. Dies kann aber erst definitiv
geschlossen werden, wenn alle Mutanten identifiziert sind.
Ergebnisse 49
4.3 CHARAKTERISIERUNG DER INTERAKTIONEN VON
SLT2 MIT SAC1
Slt2p gehört zu der Familie der MAP Kinasen. Die Aktivierung von Slt2p erfolgt über eine
Kaskade (Gustin et al., 1998). slt2 Mutanten zeigen eine Vielzahl von Phänotypen. Der
Zellwanddefekt der slt2 Stämme führt bei höheren Temperaturen zur Lyse der Zellen
(Mazzoni et al., 1993). Deshalb sind die Zellen ts, was durch osmotische Stabilisierung
verhindert werden kann (Watanabe et al., 1995). Weiter sind Aktin und Chitin bei 37°C
delokalisiert (Mazzoni et al., 1993). Ebenfalls bei 37°C sind sekretorische Vesikel, die sich
in Wildtyp Zellen in der entstehenden Tochterzelle befinden, überall im Cytosol verteilt zu
finden (Mazzoni et al., 1993). Diese Phänotypen wurden auch in Mutanten des
Cytoskeletts gefunden. Außerdem wurden ähnliche Aktin und Chitin Defekte auch in sac1
Mutanten beobachtet (Novick et al., 1989). sac1 Mutanten zeigen zusätzlich noch einen
Defekt im ATP-Transport in das ER (Mayinger et al., 1995), Inositolauxotrophie (Whitters
et al., 1993) und eine erhöhte Menge an Phosphatidylinositol-4-phosphat (PI4P) (Guo et
al., 1999). Um zu überprüfen, ob Slt2p und Sac1p in ihren bis dahin spezifischen
Funktionen weitere Überlappungen zeigen, wurden die spezifischen Phänotypen der
jeweiligen Mutante, slt2 oder sac1, in der anderen Mutante getestet. Aus den Ergebnissen
sollte sich zum einen der Grund für die synthetische Letalität von sac1 mit slt2 und zum
anderen der funktionelle Zusammenhang der beiden Gene ableiten lassen.
4.3.1 sac1
∆
slt2
∆
Zellen zeigen starken Wachstumsdefekt
Mit der Generation des sac1
∆
slt2
∆
Stammes sollte getestet werden, ob der synthetische
letale Phänotyp von sac1
∆
slt2-153N allelspezifisch ist. In (Martin et al., 1993) ist
beschrieben, daß slt2 Mutanten bei 32°C einen ts Phänotyp zeigen. Daher wurden die
slt2
∆,
sac1
∆
slt2
∆
und slt2-153N Stämme bei 25°C, 37°C und 38.5°C getestet. Anders als
in der Literatur beschrieben, zeigen die slt2
∆
Zellen den ts Phänotyp erst bei 38.5°C,
genauso wie die slt2-153N Zellen. Die sac1
∆
slt2
∆
Zellen zeigen, genau wie die sac1
∆
slt2-153N Zellen (Abb. 19), bei den höheren Temperaturen kein Wachstum und bei 25°C
sehr schwaches Wachstum (Abb. 19). Damit wurde gezeigt, daß der Wachstumsdefekt von
sac1
∆
slt2
∆
und sac1
∆
slt2-153N Stämme identisch und nicht allelspezifisch ist.
Ergebnisse 50
Außerdem läßt sich aus diesen Daten schließen, daß das slt2-153N Allel phänotypisch der
Deletionsmutante entspricht.
Abbildung 19: slt2
∆
und slt2-153N Zellen zeigen thermosensitives Verhalten bei 38.5°C. sac1
∆
slt2
∆
Zellen zeigen einen starken Wachstumsdefekt schon bei 25°C und sind ts bei 37°C. Die Zellen sind als
Verdünnungsreihe aufgetragen.
4.3.2 slt2
∆
Zellen zeigen reduzierten ATP-Transport
Eine mögliche Grundlage für die synthetischen Interaktionen von sac1
∆
slt2ts ist eine
gemeinsame Funktion von Sac1p und Slt2p im ATP-Transport. Wie schon in Kapitel
4.2.3.1 beschrieben, ist der ATP-Transport im slt2-153N Stamm verlangsamt. Um zu
entscheiden, ob der erniedrigte ATP-Transport allelspezifisch ist, oder auch in
Deletionsmutanten von SLT2 zu beobachten ist, wurde von zwei verschiedenen slt2
∆
Stämmen (ATY331 und ATY338) Mikrosomen präpariert und der ATP Transport
gemessen. Als Vergleich sind in Abb. 20A die Wildtyp-Kontrolle und slt2-153N aus Abb.
15 mit aufgetragen. Die Kinetik des ATP-Transports von slt2
∆
entspricht der von slt2-
153N Zellen und ist auf ~ 67% des Wildtyps erniedrigt. Diese Daten sind konsistent mit
der Idee, daß Slt2p und Sac1p beide eine Funktion im ATP-Transport haben, wobei unklar
bleibt, ob die Funktion von Slt2p in diesem Zusammenhang direkt oder indirekt ist. In
Abb. 20B sind die Daten dazu auf YPD und Can Platte gezeigt. Da der ATP-Transport der
slt2 Mutanten erniedrigt ist, aber das sac1-22 Allel nicht den synthetischen
Wachstumsdefekt der sac1
∆
slt2ts Zellen komplementiert, führte dies zu der Annahme, daß
der synthetische Wachstumsdefekt nicht direkt auf dem Defekt im ATP Transport beruht,
und daher kein genereller Effekt der verlangsamten Sekretion ist.
Ergebnisse 51
Abbildung 20: Zum einen wurde die Kapazität des ATP-Transports ist in slt2
∆
und slt2-153N Zellen
gemessen. Zum anderen wurde untersucht, ob das sac1-22 Allel den synthetischen Wachstumsdefekt von
sac1
∆
slt2-153N Zellen komplementiert. (A) ATP-Transport Kinetik von Wildtyp (12 Messungen), slt2
∆
(12
Messungen) und slt2-153N (6 Messungen) Stämmen. Die Kapazität für slt2
∆
und slt2-153N Stämme ist um
~23% gegenüber dem Wildtyp erniedrigt. (B) Die jeweiligen Stämme wurden auf YPD und Can Platten
ausgestrichen. Das Plasmid pAT2 (SAC1, URA3) komplementiert, während das Plasmid pAT3 (sac1-22,
TRP1) nicht den synthetischen Wachstumsdefekt von sac1
∆
slt2-153N komplementiert. Gezeigt durch
Wachstum, bzw. kein Wachstum auf der Can Platte. 1: lsa3-1, 2: lsa3-1 YCp22, 3: lsa3-1 psac1-22 und 4:
lsa3-1 pSAC1.
Ergebnisse 52
4.3.3 slt2
∆
Zellen sind inositolauxotroph, zeigen aber keine veränderte
Menge an Phosphatidylinositol-4-phosphat (PI4P)
Eine weitere Möglichkeit gemeinsamer Funktionen von Sac1p und Slt2p könnte eine Rolle
in Phosphoinositid Signalwegen sein. Wie schon in der Einleitung beschrieben, verursacht
ein Defekt im Lipid Metabolismus die Inositolauxotrophie der sac1
∆
Stämme (Rivas et al.,
1999). Daher wurden Verdünnungen von sac1
∆,
slt2
∆
und slt2-153N Zellen auf Inositol-
freien Platten getestet. Wie in Abb. 21 zu sehen ist, sind slt2
∆
und slt2-153N Mutanten
ebenfalls inositolauxotroph, zeigen aber einen schwächeren Phänotyp als sac1 Mutanten.
Die erhöhte Phosphatidylinositol-4-phosphat (PI4P) Menge in sac1 Zellen (Rivas et
al., 1999), (Stock et al., 1999) ist ein weiterer Hinweis auf eine Beteiligung von Sac1p an
den Phosphoinositid Signalwegen. Es wurde untersucht, ob dies auch für slt2 Mutanten
zutrifft. Aus den Stämmen ATY6211 (wt), ATY6212 (sac1
∆
), ATY338 (slt2
∆
), ATY352
(sac1
∆
slt2
∆
) und slt2-153N wurden die Lipide isoliert und mittels
Dünnschichtchromatographie (DC) aufgetrennt. Als Kontrollen wurde
Phosphatidylinositol (PI), PI4P und Phosphatidylinositol-4,5-diphosphat (PI4,5P2)
aufgetragen. Nach dem Trocknen wurden die aufgetrennten Phosphoinositide zuerst mit
Jod angefärbt (Abb. 22A) und dann die 14C markierten Phosphoinositide mit Hilfe eines
Phosphoimagers analysiert (Abb. 22B). Die Quantifizierung ergab, daß in den sac1
∆
Zellen gegenüber Wildtyp Zellen eine fünffach höhere Menge an radioaktiv markiertem
PI4P vorliegt, entsprechend der Ergebnisse in (Rivas et al., 1999), (Stock et al., 1999),
während bei den slt2
∆
Zellen kein Effekt zu sehen ist (Abb. 22C). Daraus läßt sich
schließen, daß Sac1p und Slt2p keine überlappende Funktion in der Phosphoinositid
Signalübertragung haben.
Abbildung 21: Verdünnungsreihen
der sac1
∆
, slt2
∆
und slt2-153N
Stämme wurden auf eine YPD und
eine Inositol-freie Platte aufgetragen.
Der sac1
∆
Stamm zeigt kein
Wachstum auf der Inositol freien
Platte, während die slt2
∆
und slt2-
153N Stämme nur bei der höchsten
Konzentration an Zellen Wachstum
zeigen. Daher sind die sac1
∆
, slt2
∆
und slt2-153N Stämme
inositolauxotroph.
Ergebnisse 53
Abbildung 22: Die
chromatographische Analyse der
Phosphoinositide. (A) Die durch die
DC aufgetrennten Phosphoinositide
wurden mit Jod angefärbt. Als
Kontrolle wurden Phosphatidylinositol
(PI), Phosphatidylinositol-4-
monophosphat (PI4P) und
Phosphatidylinositol-4,5-diphosphat
(PI4,5P2) aufgetragen. 1: ATY6211
(wt), 2: ATY6212 (sac1
∆
), 3:
ATY338 (slt2
∆
), 4: ATY352
(sac1
∆
slt2
∆
), 5: slt2-153N. (B) Auf
der DC-Platte aus (a) wurden die 14C
markierten Phosphoinositide mit Hilfe
des Phosphoimagers analysiert. 1:
ATY6211 (wt), 2: ATY6212 (sac1
∆
),
3: ATY338 (slt2
∆
), 4: ATY352
(sac1
∆
slt2
∆
), 5: slt2-153N. {(a):(b) =
1:1} (C) Die Quantifizierung der 14C
Inkorporation in PI4P. In sac1
∆
Zellen
ist die Menge an PI4P um das
fünffache gegenüber dem Wildtyp
erhöht, während bei den slt2 Allelen
kein Effekt zu sehen ist.
Ergebnisse 54
4.3.4 sac1 und slt2 Mutanten haben einen Zellwanddefekt
Die synthetischen Interaktionen könnten auch durch eine gemeinsame Funktion von Sac1p
und Slt2p in der Organisation der Zellwand verursacht werden. Um diese Hypothese zu
überprüfen, wurde die in Kapitel 4.2.4.3 beschriebene Calcofluor Weiß (CFW) Sensitivität
des slt2-153N Stammes ausgenutzt, die ein Nachweis für Zellwanddefekte ist (Madden et
al., 1997), (Igual et al., 1996), (Ram et al., 1994). Der Zellwanddefekt von slt2 Mutanten
wurde schon in (Martin et al., 1993) beschrieben. Auf YPD Platten mit und ohne 0.02
mg/ml CFW wurden Verdünnungsreihen der sac1
∆
, sac1-22, slt2
∆
und slt2-153N Stämme
getestet. Wie in Abb. 23 zu sehen ist, zeigt keiner dieser Stämme Wachstum auf den CFW
Platten. Aus dieser CFW Sensitivität läßt sich schließen, daß sowohl slt2 als auch sac1
Mutanten einen Zellwanddefekt haben. Dieses Ergebnis ist konsistent mit der Hypothese,
daß Slt2p und Sac1p an der Organisation der Zellwand beteiligt sind.
Abbildung 23: Die sac1 und slt2 Mutanten wurden auf CFW Platten getestet, mit denen spezifisch ein
Zellwanddefekt nachgewiesen werden kann. Verdünnungsreihen der Stämme wurden auf je eine YPD und
YPD mit 0.02 mg/ml CFW Platte aufgetragen. Alle sac1 und slt2 Allele zeigen kein Wachstum auf der CFW
Platte, was auf einen Zellwanddefekt deutet. Die Platten wurden zwei Tage bei 25°C inkubiert.
Der gemeinsame Zellwanddefekt der slt2 und sac1 Mutanten könnte der Grund für den
synthetischen Wachstumsdefekt sein. Für verschiedene Zellwandmutanten kann die Lyse
der Zellen bei höheren Temperaturen durch osmotische Stabilisierung mit 1 M Sorbitol
verhindert werden (Levin and Bartlett-Heubusch, 1992), (Watanabe et al., 1995). Daher
wurde untersucht, ob dies ebenfalls für den Wachstumsdefekt der sac1
∆
slt2
∆
Ergebnisse 55
Abbildung 24: Es wurde untersucht, ob durch osmotische Stabilisierung mit 1 M Sorbitol der synthetische
Wachstumsdefekt der sac1
∆
slt2
∆
Zellen supprimiert werden kann. (A) Der thermosensitive Phänotyp bei
37°C kann durch Sorbitol verhindert werden. Die Zellen sind als Verdünnungsreihe aufgetragen. (B) In
Flüssigkultur kann der starke Wachstumsdefekt der sac1
∆
slt2
∆
Zellen durch die Zugabe von Sorbitol
verhindert werden. Die Kontrollkultur wurde in YPD mit 1 M Sorbitol hochgezogen. Aus dieser Kultur
wurde ein Aliquot entnommen, und die Zellen wurden in YPD überführt. Die Zelldichte wurde durch Messen
der OD
600
und Auszählen bestimmt.
Doppelmutante zutrifft. Die slt2
∆
und sac1
∆
slt2
∆
Stämme wurden bei 37°C auf YPD mit
1 M Sorbitol getestet. Wie in Abb. 24A gezeigt, können sac1
∆
slt2
∆
Zellen auf dem
osmotisch stabilisierenden Medium wachsen. Die slt2
∆
Zellen zeigen auf den Sorbitol
Platten verbessertes Wachstum, was bei den niedrigeren Konzentrationen in der
Verdünnungsreihe zu erkennen ist (Abb. 24A). Zur Quantifizierung dieses Ergebnisses
wurde die Wachstumsgeschwindigkeit dieser Zellen in Flüssigkultur mit und ohne 1 M
Sorbitol bei 30°C gemessen. Dazu wurden die sac1
∆
slt2
∆
Zellen bis zu einer OD
600
von
0.01 in YPD mit 1 M Sorbitol hochgezogen, dann wurde ein Aliquot der Zellen
Ergebnisse 56
entnommen und in YPD Medium überführt. Die Kulturen wurden weiter bei 30°C
inkubiert, alle zwei Stunden wurde die OD600 bestimmt. Wie in Abb. 24B zu sehen ist,
können die sac1
∆
slt2
∆
Zellen in Sorbitol Medium wachsen, während ohne Sorbitol das
Wachstum stagniert. Wurden die Zellen nach ~ 8 h Inkubation in YPD Medium wieder in
YPD mit Sorbitol überführt, so zeigten sie für ~ 5 h weiterhin sehr wenig Wachstum,
hatten aber nach insgesamt ~ 18 h annähernd die Zelldichte der Kontrollkultur erreicht
(Daten nicht gezeigt). Die Überlebensrate nach 8 h Inkubation in YPD Medium wurde auf
YPD Platten mit 1 M Sorbitol zu ~ 36% im Vergleich zu ~ 33% der Kontrollkultur
bestimmt. Als Standard wurde ein Wildtyp Stamm verwendet. Dies läßt die
Schlußfolgerung zu, daß der Zellwanddefekt, den sac1 und slt2 Mutanten zeigen, für den
synthetisch letalen Phänotyp der Doppelmutante verantwortlich ist, da dieser Phänotyp
nicht in osmotisch stabilisierendem Medium zu beobachten ist.
4.3.5 Fehlerhafte Anreicherung von Chitin zwischen Mutter- und
Tochterzelle in sac1
∆
slt2
∆
Zellen führen zu einem
Separationsdefekt
Da ein Zellwanddefekt offensichtlich für den synthetischen Wachstumsdefekt
verantwortlich ist, wurden die anschließenden Experimente auf die Untersuchung der
Morphologie der Zellen ausgerichtet. Von slt2 Mutanten ist bekannt, daß sie bei 37°C zu
71 % als einzelne Zellen vorliegen, bevor sie lysieren (Mazzoni et al., 1993). Da dieser
Phänotyp unter dem Lichtmikroskop zu sehen ist, wurden die sac1
∆
slt2
∆
Zellen ebenfalls
so betrachtet. Dazu wurden Übernachtkulturen der sac1
∆
slt2
∆
Zellen in YPD mit oder
ohne 1 M Sorbitol bei 30°C hochgezogen. Wurden diese Zellen nach 15 h unter dem
Mikroskop verglichen, zeigte sich eine Akkumulation an großen geknospten Zellen in der
Kultur ohne Sorbitol, während die Zellen in der Kultur mit Sorbitol in allen Stadien des
Zellzyklus zu sehen sind (Abb. 25A). Der synthetische Wachstumsdefekt könnte somit auf
einem Zellteilungsdefekt beruhen. Um davon ein genaueres Bild zu bekommen, wurden
sac1
∆
slt2
∆
Zellen in YPD ebenfalls unter dem Laser Scanning Elektronen Mikroskop
näher betrachtet. In Abb. 25B sind zwei repräsentative Beispiele zu sehen. Der Bereich
zwischen Mutter- und Tochterzelle (Pfeile) ist in diesen Zellen jeweils stark verlängert.
Ergebnisse 57
Ergebnisse 58
Abbildung 25: (vorherige Seite) Morphologie der sac1
∆
slt2
∆
Zellen. (A) Wurden diese Zellen in YPD
hochgezogen, so lag die Mehrzahl der Zellen als große geknospte Zellen vor (rechte Abbildung). In mit 1 M
Sorbitol supplementiertem YPD lagen die Zellen in allen Stadien des Zellzyklus vor (linke Abbildung). (B)
Die Region zwischen Mutter- und Tochterzelle ist in sac1
∆
slt2
∆
Zellen, die in YPD hochgezogen wurden,
stark elongiert. Als Kontrolle ist links oben Wildtyp abgebildet. Rechts oben sind sac1
∆
slt2
∆
Zellen
abgebildet, die Pfeil zeigen auf die elongierte Region. Die beiden unteren Abbildungen sind Vergrößerungen
der mit Pfeil markierten Zellen aus der oberen rechten Abbildung. Die Aufnahmen wurden mit einem Laser
Scanning Elektronen Mikroskop gemacht.
In Wildtyp Hefezellen spaltet sich die Tochter- von der Mutterzelle ab, sobald die
Tochterzelle annähernd die Größe der Mutterzelle erreicht hat. Dazu muß zuerst die
Kernteilung und dann die Cytokinese stattfinden. Anschließend kommt es zur Separation
der Zellen. Ein möglicher Grund für die in YPD vorliegenden großen geknospten sac1
∆
slt2
∆
Zellen könnte ein Defekt in der Kernteilung sein. Um diese Hypothese zu
überprüfen, wurde die genomische DNA der sac1
∆
slt2
∆
Zellen in YPD mit DAPI
angefärbt und unter dem Fluoreszenzmikroskop sichtbar gemacht (Abb. 26). Die
Normarski Aufnahmen zeigen drei Ausschnitte mit großen geknospten Zellen aus einer
Übernachtkultur, darunter ist das jeweilige Fluoreszenzbild abgebildet. Jede Zelle besitzt
einen Kern, der keinerlei Besonderheiten aufweist. Die sac1
∆
slt2
∆
Zellen zeigen also
keinen Defekt in der Kernteilung.
Abbildung 26: Fluoreszenzmarkierte Zellkerne der sac1
∆
slt2
∆
Zellen. Die obere Reihe zeigt drei
Nomarski Ausschnitte, die untere Reihe die dazugehörigen Fluoreszenzbilder. Jede dieser Zellen hat einen
eigenen Zellkern, in dem rechten Ausschnitt findet gerade die Kernteilung statt.
Ergebnisse 59
Da die sac1
∆
slt2
∆
Zellen in YPD als große geknospte Zellen arretierten und keinen
Defekt in der Kernteilung aufweisen, wurde untersucht, ob die Zellen die Cytokinese
vollendet hatten. Haben die beiden Zellen jeweils eine eigene Plasmamembran und damit
die Cytokinese abgeschlossen, aber eine gemeinsame Zellwand, so lassen sich die beiden
Zellen durch Abbau der Zellwand voneinander trennen. Daher wurde mit 1 mg/ml
Zymolyase aus den sac1
∆
slt2
∆
Zellen Spheroblasten hergestellt. Anschließend wurde
unter dem Mikroskop die Anzahl verschiedener Zelltypen (ungeknospt, mit kleiner oder
großer Knospe, Zellhaufen) in einem Ausschnitt bestimmt. Wie in Abb. 27 dargestellt ist,
lagen vor der Zymolyase Behandlung 2/3 der Zellen mit großen Tochterzellen oder als
Zellhaufen vor, während nach der Behandlung 2/3 der Zellen als einzelne Zellen ohne
Knospe vorlagen. Aus der stark gestiegenen Anzahl an einzelnen Zellen nach der
Zymolyasebehandlung wurde geschlossen, daß die sac1
∆
slt2
∆
Zellen keinen Defekt in der
Cytokinese haben.
Abbildung 27: Analyse der verschiedenen sac1
∆
slt2
∆
Zelltypen in YPD Medium. Die in YPD hochgezogenen
Zellen wurden mit Zymolyase behandelt und die Anzahl
der verschiedenen Zelltypen (ungeknospt, mit kleiner oder
großen Knospe, Zellhaufen) bestimmt und mit der Anzahl
dieser Zelltypen vor der Zymolyase Behandlung
verglichen.
Der Zellteilungsdefekt der sac1
∆
slt2
∆
Zellen könnte mit der Zusammensetzung der
Zellwand zusammenhängen. Ein wichtiger Bestandteil, der für die korrekte Teilung der
Zellen benötigt wird, ist das Chitin. Beginnt eine Zelle zu knospen, so bildet sich als erstes
ein Chitinring zwischen Mutter- und entstehender Tochterzelle. Die Anlagerung von Chitin
wird fortgesetzt, bis die Tochterzelle annähernd die Größe der Mutterzelle erreicht hat. Mit
Beginn der Cytokinese „wächst“ das Chitin mit der Plasmamembran nach innen, um das
Primäre Septum zu formen. Das Sekundäre Septum wird anschließend beidseitig von β-
Glukan und Mannan gebildet. Hat sich die Tochterzelle von der Mutterzelle getrennt, so
bleibt eine Narbe in der Zellwand der Mutterzelle übrig, die reich an Chitin ist (Cid et al.,
1995). Chitin kann unter dem Fluoreszenzmikroskop mit CFW sichtbar gemacht werden
- zymolyase
31
3
37
29
+ zymolyase
72
3
13
12
cell type (%)
15h in YPD
Ergebnisse 60
(Adams et al., 1997). Es wurde also untersucht, wie die Verteilung des Chitins in den
sac1
∆
slt2
∆
Zellen im Vergleich zu Wildtyp Zellen aussieht. In Wildtyp Zellen sind der
Chitinring zwischen Mutter- und Tochterzelle und die Narben auf der Zelloberfläche gut
zu erkennen, während die Tochterzellen erst kurz vor der Separation Chitinfärbung zeigen
(Abb. 28). In den sac1
∆
slt2
∆
Zellen ist der Chitinring zwischen Mutter- und Tochterzelle
viel breiter und teilweise ist Chitin in den Tochterzellen sichtbar. Die in Sorbitol
hochgezogenen Zellen zeigen eine Delokalisierung von Chitin, aber nicht die starke
Anreicherung von Chitin. slt2
∆
Zellen zeigen in dieser Hinsicht bei der permissiven
Temperatur keinen Phänotyp, während bei 37°C ebenfalls eine Delokalisation von Chitin
beobachtet wurde (Mazzoni et al., 1993).
Das Chitin, das das primäre Septum bildet, ist elektronentransparent und hebt sich daher
hell von den elektronendichteren dunklen sekundären Septa in elektronenmikroskopischen
Aufnahmen ab (Shaw et al., 1991). Die Septa der sac1
∆
slt2
∆
Zellen zeigen im Vergleich
zum Wildtyp mehrere Schichten von Chitin. Außerdem sieht der Aufbau der Septa
gegenüber dem Wildtyp stark verändert aus (Abb. 29).
Zusammengefaßt zeigen die sac1
∆
slt2
∆
Zellen weder einen Defekt in der Kernteilung
noch in der Cytokinese. Dagegen zeigt die Region zwischen Mutter- und Tochterzelle eine
starke Anreicherung an Chitin, und die Zusammensetzung des Septums ist gestört. In
(Igual et al., 1996) wurde gezeigt, daß die Expression verschiedener Gene, die für die
Zellwandbiosynthese benötigt werden (GLS1, FKS2, MNN1 und CHS3) von Slt2p
abhängig ist. Außerdem kann die Aktivierung des Pkc1 Weges bei hohen Temperaturen
durch osmotische Stabilisierung verhindert werden (Kamada et al., 1995). Parallel dazu
zeigt sich der synthetische Wachstumsdefekt der sac1 slt2 Zellen nicht in osmotisch
stabilisierendem Medium. Daraus läßt sich schließen, daß in sac1
∆
slt2
∆
Zellen die falsche
Zusammensetzung der Zellwand, wahrscheinlich ausgelöst durch fehlende Regulation, der
Grund für den Teilungsdefekt ist.
Abbildung 28: (nächste Seite) Das Chitin der sac1
∆
slt2
∆
Zellwand wurde untersucht. Die Zellen
wurden mit CFW angefärbt und mit dem UV-Filter betrachtet. Die oberen Reihen sind Nomarski
Aufnahmen, die unteren Reihen die dazugehörigen Fluoreszenzbilder, die die Chitinfärbung zeigen. (A)
Wildtyp Kontrolle. Das Chitin ist als schmaler Ring zwischen Mutter- und Tochterzelle sichtbar. (B) sac1
∆
slt2
∆
Zellen, die in YPD hochgezogen wurden. Das Chitin ist als sehr breiter Ring zwischen Mutter- und
Tochterzelle und teilweise auch in der Tochterzelle sichtbar. (C) sac1
∆
slt2
∆
Zellen, die in YPD mit 1 M
Sorbitol hochgezogen wurden. Die Intensität der Chitinfärbung entspricht der Wildtyp Kontrolle, aber eine
Delokalisation ist sichtbar.
Ergebnisse 61
Ergebnisse 62
Abbildung 29: Elektronenmikroskopische Aufnahmen von Schnitten der Septa von Wildtyp (links oben),
sac1
∆
(rechts oben), slt2
∆
(links unten) und sac1
∆
slt2
∆
(rechts unten) Zellen. In den Wildtyp, sac1
∆
und
slt2
∆
Zellen ist das primäre Septum als helle Bande zwischen den dunklen sekundären Septa zu erkennen.
Dagegen zeigt das Septum der sac1
∆
slt2
∆
Zellen eine stark veränderte Struktur.
4.4 EPISTATISCHE ANALYSE
Slt2p und Sac1p zeigen eine gemeinsame Funktion bei der Regulation des
Zellwandaufbaus, speziell in der Koordination der Zellseparierung. Verschiedene
Möglichkeiten bieten sich an, wie die beiden Proteine an dieser Regulation beteiligt sind.
Ergebnisse 63
Entweder sind beide Proteine im selben Signalweg oder parallel zueinander aktiv. Sind sie
an der selben Signalkette beteiligt, so ist Sac1p entweder oberhalb oder unterhalb von
Slt2p aktiv.
4.4.1 SAC1 und SLT2 sind parallel zueinander aktiv
Um nun herauszufinden, ob die beiden Gene im gleichen Weg oder in verschiedenen
Wegen parallel zueinander aktiv sind, wurde versucht, ob die Überexpression von SAC1 in
slt2
∆
Zellen, bzw. SLT2 in sac1
∆
Zellen, den CFW sensitiven Phänotyp und die
Inositolauxotrophie suppressieren kann. Wie schon in Kapitel 4.2.5.2 beschrieben, kann
solch ein Experiment über das Verhältnis der beiden Gene zueinander Auskunft geben.
Dazu wurden die jeweiligen Stämme auf YPD Platten mit und ohne CFW bzw. Inositol
gestempelt. Wie in Abb. 30 zu sehen ist, findet in beiden Fällen keine Suppression statt.
Zusammen mit dem synthetischen Wachstumsdefekt wurde daraus geschlossen, daß die
Funktion beider Gene parallel zueinander sein muß.
Abbildung 30: Es wurde untersucht, ob Sac1p und Slt2p in der selben Signalkaskade aktiv sind. Die
jeweiligen Stämme sind als Verdünnungsreihe auf je eine YPD, CFW und Inositol-freie Platte aufgetragen.
Die Überexpression von SAC1 im slt2
∆
Stamm und die Überexpression von SLT2 im sac1
∆
Stamm zeigt
keinen Effekt auf das fehlende Wachstum auf der CFW und Inositol-freien Platte. Daher üben Sac1p und
Slt2p parallel zueinander ihre Funktion aus.
Ergebnisse 64
Parallel zu der Slt2p MAPK Kaskade werden noch weitere Proteine (Gls1p4, Bni1p5 und
Skn7p6) von Rho1p reguliert (Helliwell et al., 1998). Die Doppeldeletionen von SLT2 mit
GLS1 (Garrett-Engele et al., 1995)oder BNI1 (Fujiwara et al., 1998) sind synthetisch letal.
Um nun zu testen, ob SAC1 ebenfalls parallel zu diesen Genen agiert, wurde die
Doppeldeletion von SAC1 und BNI1 untersucht. Die Stämme ATY358 (bni1::URA3) und
ATY6212 (sac1::TRP1) und als Kontrolle ATY355 (wt) und ATY6212 (sac1::TRP1)
wurden gekreuzt und die resultierenden Diploiden sporuliert. Anschließend wurden 20
Tetraden der Doppelmutante und 13 Tetraden der Kontrolle dissektiert und die
hochgewachsenen Sporen analysiert. In Abb. 31 sind die hochgewachsenen Sporen von je
acht Tetraden zu sehen. Da alle vier Sporen lebensfähig sind, wurden synthetische
Interaktionen zwischen BNI1 und SAC1 ausgeschlossen, das heißt SAC1 agiert nicht direkt
parallel zu BNI1.
Abbildung 31: Um zu Aufschluß zu erhalten, ob SAC1, wie SLT2 und BNI1 durch PKC1 reguliert wird,
wurde untersucht ob sich genetische Interaktionen von SAC1 mit BNI1 nachweisen lassen. Die
Tetradenanalyse der aus der Kreuzung von bni1::URA3 mit sac1::TRP1 (links) resultierenden Sporen zeigt
keinen Unterschied gegenüber der Kontrolle (rechts). Die Sporen einer Tetrade wurden untereinander
abgelegt. Daher findet keine synthetische Interaktion zwischen SAC1 und BNI1 statt und SAC1 ist vermutlich
nicht direkt parallel zu BNI1.
4 Komponente der Glucan Synthase
5 Beteiligt an der Organisation des Aktin Cytoskeletts
6 Transkriptionsfaktor
Diskussion 65
5 DISKUSSION
5.1 ATP-TRANSPORT UND TRANSLOKATION IN DAS ER
Die präsentierten Daten bestätigen, daß Sac1p direkt in den mikrosomalen ATP-Transport in
Hefe involviert ist. In vitro war bereits gezeigt worden, daß in Mikrosomen aus sac1
Deletionsmutanten die ATP-Transportrate drastisch reduziert ist (Mayinger et al., 1995).
Außerdem zeigten sac1
∆
Stämme verlangsamte Sekretion (Kochendorfer et al., 1999). In der
vorliegenden Arbeit wurde mit Hilfe von genetischen Interaktionen die biochemischen Daten
in vivo bestätigt. Bei der posttranslationalen Translokation ist die Präsenz von ATP für die
korrekte Funktion von Sec63p und Sec61p essentiell (Lyman and Schekman, 1997).
Erwartungsgemäß konnten synthetisch letale Interaktionen zwischen sac1
∆
und sec61ts, bzw.
sec63ts gezeigt werden. Die Funktion von Sec62p ist nicht ATP-abhängig und sein Gen zeigt
auch keine genetische Interaktion mit SAC1. Durch den Einsatz des sac1-22 Allels konnte
ausgeschlossen werden, daß die synthetische Letalität von sac1
∆
sec61ts und sac1
∆
sec63ts
durch den Defekt im Lipidmetabolismus verursacht wird, da sac1-22 Zellen zwar den Defekt
im Phospholipid Metabolismus zeigen, aber wie Wildtyp ATP transportieren (Kearns et al.,
1997). Daraus wurde geschlossen, daß die synthetisch letalen Interaktionen auf einem Mangel
an ATP im ER Lumen beruhen und damit in vivo die Proteintranslokation direkt von dem
ATP-Transport in das ER abhängt. Die Ergebnisse entsprechen dem Modell der
Proteintranslokation, wobei Sec61p und Sec63p Komponenten eines funktionellen Komplexes
sind, für den ATP essentiell ist, um Vorläuferproteine durch die ER Membran zu
translozieren. Die Rekrutierung der Vorläuferproteine an das ER Translokon durch Sec62p ist
unabhängig von luminalem ATP (Lyman and Schekman, 1997).
Zusammengenommen deuten die biochemischen und genetischen Daten auf eine
wichtige Funktion von Sac1p im mikrosomalen ATP-Transport und beweisen, daß diese
Funktion sich von der Rolle im Golgi Phospholipid Metabolismus unterscheidet. Es gilt noch
aufzuklären, wie Sac1p im ATP-Transport in das ER und im Golgi Phospholipid
Metabolismus involviert ist. Dieses Ergebnisse könnten über eine mögliche Verbindung
zwischen metabolischer Energieversorgung im ER und Golgi Funktion Aufschluß geben.
Möglicherweise könnte Sac1p über Phosphoinositide in Kompartiment-spezifischen
Signalwegen involviert sein, da Sac1p in ER und Golgi Membranen lokalisiert ist.
Diskussion 66
5.2 DER SYNTHETISCH LETALE SCREEN
Ziel des synthetisch letalen Screens war es, Faktoren zu identifizieren, deren Funktion in
sac1
∆
Zellen essentiell ist. Da Sac1p an verschiedenen zellulären Funktionen beteiligt ist,
wurde erwartet, daß die isolierten Gene an dem ATP-Transport in das ER, dem Phospholipid
Metabolismus oder der Organisation des Aktin Cytoskeletts beteiligt sind.
Aus den ATP-Transport Daten läßt sich noch nicht schließen, ob der ATP-Transporter
des ERs einer der Mutanten ist. Ist nur ein Protein dafür zuständig, so ist vermutlich eine
Punktmutation im aktiven Zentrum letal, zeigt aber vielleicht an einer anderen Position im
Protein nur einen milden Phänotyp, wie z. B. eine leicht reduzierte ATP-Transportrate.
Besteht der ATP-Transporter aus einem Komplex von Proteinen, so könnte eine Mutation in
einer Komponente ebenfalls nur zu einem leichten Phänotyp führen. Daher kommen vier
Mutanten in die engere Auswahl zur weiteren Charakterisierung, bei denen die ATP-
Transportrate verlangsamt ist und der synthetisch letale Phänotyp durch das sac1-22 Allel
supprimiert wird. Eine weitere Gruppe von Mutanten, bei denen das sac1-22 Allel den
synthetisch letalen Phänotyp komplementiert und die ATP-Transportrate dem Wildtyp
entspricht, könnte Faktoren enthalten, die für ihre korrekte Funktion ATP benötigen. Dagegen
deutet die Gruppe der Mutanten, die Wildtyp ATP-Transportrate zeigen und das sac1-22 Allel
nicht den synthetisch letalen Phänotyp komplementiert, auf Faktoren, die mit oder parallel zu
SAC1 an Signalübertragungen beteiligt sind.
Die isolierten Mutanten wurden auch auf einen Zellwanddefekt hin untersucht und
konnten daraufhin in zwei Gruppen bezüglich der CFW Sensitivität eingeteilt werden. Auch
in den sac1 Mutanten wurde ein Zellwanddefekt nachgewiesen. Hier läßt sich argumentieren,
daß eine spezielle Funktion von Sac1p, die nicht ausschließlich ATP-abhängig ist, an der
Zellwandorganisation beteiligt ist. Interessant wäre es, zu untersuchen, ob Sekretionsmutanten
einen Zellwanddefekt haben, da die Enzyme für die Biosynthese von Chitin sekretorische
Proteine sind. Die CFW Sensitivität der einzelnen Mutanten könnte auf einem Defekt in der
Sekretion der Chitin Synthese Enzyme beruhen. Ein Defekt im Transport zu den Chitosomen
oder defekte Regulation der Expression oder des Abbaus sind ebenfalls nicht auszuschließen.
Die Identifizierung der mutierten Gene wird darüber weiter Aufschluß geben.
Die große Anzahl der Komplementationsgruppen, nur zwei Gruppen weisen mehr als
ein Allel auf, und die fehlende Isolierung der SEC61 und SEC63 Gene, deutet daraufhin, daß
der Screen nicht gesättigt ist. Die Anzahl der synthetisch letalen Gene mit SAC1 könnte sich
also durch weitere Suchen noch erhöhen.
Diskussion 67
5.3 Die MAP Kinase Slt2p interagiert genetisch mit Sac1p
Abbildung 32: MAPK Kaskaden von S. cerevisiae. Es gibt vier MAPK Wege in vegetativ wachsenden Hefen
und einen, den Sporulations Weg, der nur in sporulierender Hefe exprimiert wird. Die Fragezeichen indizieren,
daß die Protein Kinase für diesen Schritt in der Kaskade noch nicht identifiziert wurde. Jede Kaskade hat eine
einzige MAPK. Zusätzlich sind einige Protein Kinasen in mehr als einem Weg aktiv: Die MEK Ste7p (zwei
Wege), die MEKK Ste11p (drei Wege) und die obere MAPK Kaskade aktivierende Kinase Ste20p (zwei Wege).
Die Pfeile repräsentieren bekannte oder postulierte Schritte in der Signaltransduktion. Angepaßt aus (Gustin et
al., 1998).
In eukaryotischen Zellen nehmen die mitogen-aktivierten Protein Kinase (MAPK) Kaskaden
eine Schlüsselfunktion im Weiterleiten von Signalen von der Zelloberfläche zum Kern ein
(MAPKKK (MAPK Kinase Kinase, MEKK), MAPKK (MAPK Kinase, MEK), MAPK). Das
Signal, das zur Aktivierung der MAPK Kaskade führt, wird durch eine Vielzahl von
Rezeptoren wahrgenommen: G-Protein-gekoppelte 7-Trans-Membran (TM) Rezeptoren, His-
Asp-Phophorelay Sensoren, Rezeptor-Tyrosin Kinasen und Integrale Membran Proteine. Das
Ziel der Aktivierung der MAPK Kaskade ist meist ein Transkriptionsfaktor, wobei auch
andere Ziele modifiziert werden können. Die spezifische Regulation der hochkonservierten
MAPK wird durch den Einsatz von „Gerüst-“ oder Ankerproteinen erreicht, die die MAPK
Module organisieren. Durch die Bindung dieser Proteine an ihre Substrate werden die
jeweiligen Wege aktiviert oder inaktiviert, und die Spezifität des Signals wird dadurch
sichergestellt (Whitmarsh and Davis, 1998). Bis jetzt wurden fünf MAP Kinase Wege (Abb.
32) in der Hefe Saccharomyces cerevisiae identifiziert, die die Paarung (Fus3p) (Farley et al.,
Diskussion 68
1999), die Antwort auf hohe Osmolarität im Medium (Hog1p) (O'Rourke and Herskowitz,
1998), das invasive Wachstum diploider Zellen (Kss1p) (Cherkasova et al., 1999), die
Sporulation diploider Zellen (Smk1p) (Ufano et al., 1999) und die Aufrechterhaltung der
zellulären Integrität bei Stress und niedriger Osmolarität (Slt2p) (Heinisch et al., 1999)
regulieren (Gustin et al., 1998).
Abbildung 33: Schematische Darstellung der
Hauptkomponenten des Hefe Pkc1p-Weges.
Komponente „X“ zeigt, daß die Verbindung
zwischen Zellzyklus Regulation und DAG
Konzentration noch aufgeklärt werden muß. Der
zentrale Komplex der MAPK Kaskade enthält
zum einen dimeres Bck1p und zum anderen beide
Proteine, Mkk1p und Mkk2p. Dieses Modell
basiert alleine auf „two-hybrid“ Daten. Im
aktivierten Status wird der Komplex
wahrscheinlich durch die Interaktion mit Rho1p
an die Membran rekrutiert. Angepaßt aus
(Heinisch et al., 1999) und (Helliwell et al.,
1998).
Die MAPK Slt2p wird spezifisch in den Phasen stark polarisierten Zellwachstums
während des Zellzyklus bei der Bildung einer Tochterzelle (Martin et al., 1993), oder durch
Pheromon induzierte Formation einer Projektion (Buehrer and Errede, 1997), auch Shmoo
genannt, aktiviert. Zusätzlich wird Slt2p durch Hitze und hypo-osmotische Konditionen
phosphoryliert und damit aktiviert (Zarzov et al., 1996). Die Slt2p MAPK Kaskade wird von
der Protein Kinase C (Pkc1p) aktiviert (Heinisch et al., 1999). Pkc1p (Abb. 33) wird durch
das kleine GTP-bindende Protein Rho1p kontrolliert, das ebenfalls die Glucan Synthase,
Gls1p und Gls2p, die an der Synthese eines Hauptbestandteils der Hefezellwand beteiligt ist
und auch Bni1p
7
, das an der Organisation des Aktin Cytoskeletts beteiligt ist, und Skn7p
8
, ein
7
Hefedatenbank: http://quest7.proteom.com/YPD/BNI1.html
Diskussion 69
nicht weiter charakterisierter Transkriptionsfaktor, reguliert (Helliwell et al., 1998). Es wird
vermutet, daß Pkc1p noch weitere Proteine aktiviert, die parallel zu der Slt2p-Kaskade aktiv
sind (Gray et al., 1997).
Die in dieser Arbeit mit dem EMS eingeführte chromosomale Mutation an Position
457 der codierenden Region von SLT2 führt zu einem Austausch von Asparaginsäure (Asp)
zu Asparagin (Asn) in Slt2p und zu einem Verlust der Aktivität des Proteins. Diese Asp liegt
in einer in allen Proteinkinasen hochkonservierten Domäne und ist die essentielle katalytische
Base der Phosphat-Transfer-Reaktion (Taylor et al., 1993). Die katalytische Domäne ist 250 –
300 Aminosäuren lang und katalysiert den Transfer zweier Gamma Phosphate von ATP auf
zwei Hydroxygruppe eines Serins und Threonins oder Threonins und Tyrosins (jeweils durch
eine Aminosäure getrennt). Außerdem enthält die katalytische Domäne aller Kinasen 12
invariante oder hochkonservierte Aminosäuren, die kritisch für die Aktivität der jeweiligen
Kinase sind (Banuett, 1998). Damit ist der Verlust des aktiven Zentrums der Grund für den
offensichtlichen Nullphänotyp des slt2-153N Allels.
Die Basis für die synthetisch letalen Interaktionen zwischen sac1 und slt2 ist eine
gemeinsame Funktion der beiden Proteine in der Organisation der Zellwand. Durch die
fehlende Komplementation des sac1-22 Allels konnte ausgeschlossen werden, daß ein Defekt
im ATP-Transport für den synthetisch letalen Phänotyp verantwortlich ist. Die leicht
erniedrigte ATP-Transportrate der slt2 Mutanten könnte ein direkter oder indirekter Effekt
sein. Da Slt2p Transkriptionsfaktoren reguliert, könnte z. B. ein bis jetzt noch nicht
identifizierter Transkriptionsfaktor am ATP-Transport oder dessen Regulation beteiligt sein.
Ebenfalls ausgeschlossen wurde eine überlappende Funktion von Sac1p und Slt2p im
Phosphoinositid Metabolismus. Die Inositolauxotrophie der slt2 Mutanten sprach zwar für
diese Hypothese, aber die Analyse der relativen Mengen an Phosphatidylinositol-4-Phosphat
(PI4P) zeigte in den slt2 Mutanten, im Gegensatz zu den sac1 Mutanten, keine Erhöhung.
Dies bedeutet, daß Slt2p nicht an der selben Phosphoinositid Signalübertragung beteiligt ist,
wie Sac1p.
Die Untersuchungen der Zellwand zeigten, daß Sac1p und Slt2p in der
Zellwandorganisation involviert sind, und daß ein Zellwanddefekt den synthetisch letalen
Phänotyp von sac1 slt2 Zellen verursacht. Für slt2 Mutanten, als auch sac1 Mutanten (sac1
∆
und sac1-22), konnte CFW Sensitivität nachgewiesen werden, die spezifisch auf einen
Zellwanddefekt deutet (Madden et al., 1997), (Igual et al., 1996), (Ram et al., 1994). Die
Suppression des synthetischen Wachstumsdefekts der sac1 slt2 Zellen durch osmotische
8 Hefedatenbank: http://quest7.proteom.com/YPD/SKN7.html
Diskussion 70
Stabilisierung lieferte den entscheidenden Hinweis, daß ein Zellwanddefekt für den letalen
Phänotyp verantwortlich ist. Durch die licht- und elektronenmikroskopischen Analysen wurde
diese These bekräftigt.
Die Kernteilung und die Cytokinese in den sac1 slt2 Zellen zeigen keinen Phänotyp. Da
aber die Zellen kurz vor der Teilung arretieren, scheint die Koordination der Zellseparierung
defekt zu sein. Chitin ist erst als Ring um den Hals der entstehenden Tochterzelle zu sehen
und wird anschließend für die Bildung des primären Septums bei der Cytokinese eingebaut
(Cid et al., 1995). In dem Septum der sac1 slt2 Zellen ist das Chitin, wenn sie in YPD
kultiviert wurden, stark angereichert, und der Aufbau des Septums ist im Vergleich zum
Wildtyp gestört. Bei osmotischer Stabilisierung wird dieser Phänotyp supprimiert, aber das
Chitin ist, wie in slt2 Mutanten, delokalisiert (Mazzoni et al., 1993). Aus diesen Daten ist
nicht ersichtlich, wodurch die Akkumulation von Chitin ausgelöst wird und wie das Medium
die Zellseparierung beeinflussen kann.
In Hefe existieren drei Chitin Synthase Komplexe (CSI, CSII und CSIII). Chs1p (CSI)
ist verantwortlich für die Reparatur der Zellwand nach der Separation der Tochter- von der
Mutterzelle. Das Primäre Septum wird durch Chs2p (CSII) gebildet, und Chs3p, als
katalytische Komponente des CSIII, bildet den Ring, durch den die neue Knospe entsteht. Ein
allgemeiner Regulationsmechanismus der Chitin Biosynthese ist die Lagerung der Enzyme in
einer intrazellulären Membranfraktion, den Chitosomen. Chs1p und Chs3p werden von der
Plasmamembran zu den Chitosomen und zurück transportiert, während Chs2p weiter zu der
Vakuole transportiert und abgebaut wird (Chuang and Schekman, 1996), (Cid et al., 1995).
Die Regulation der Expression von CHS3 und weiteren an der Zellwandbiosynthese
beteiligten Genen hängt von Slt2p ab, das für die zelluläre Integrität verantwortlich ist
(Heinisch et al., 1999). Die in slt2 Mutanten angereicherten sekretorische Vesikel (Mazzoni et
al., 1993) könnten Proteine enthalten, die für die Zellwand bestimmt sind, was den
Zellwanddefekt erklären würde. Außerdem könnte Slt2p nicht nur an der Expression von
Zellwandproteinen, sondern auch an deren korrekter Lokalisation beteiligt sein, ähnlich wie
die MAP Kinase Hog1p für die korrekte Lokalisation von Mnn1p9 im Golgi benötigt wird
(Reynolds et al., 1998). Es ist daher wahrscheinlich, daß in den sac1 slt2 Zellen die fehlende
Koordination der Phosphoinositidsignale zu fehlerhafter Regulation und Lokalisation der
biosynthtischen Enzyme der Zellwand führt, was der Grund für die Anreicherung an Chitin
ist.
9 Alpha-1,3-Mannosyltransferase
Diskussion 71
5.4 DER Sac1p SIGNALWEG IST PARALLEL ZU DER Slt2p
MAPK KASKADE
Sac1p agiert parallel zu der Pkc1p abhängigen Slt2p MAPK Kaskade (Abb. 34). Daß Sac1p
und Slt2p im selben Weg aktiv sind, wurde durch die Überexpression von SAC1 in slt2
∆
Zellen, bzw. SLT2 in sac1
∆
Zellen ausgeschlossen. Als weitere Möglichkeit wurde in
Betracht gezogen, daß Sac1p von Pkc1p reguliert wird und damit ein noch fehlendes Glied in
der Kette gefunden wurde. Mehrere Gründe sprechen gegen diese Hypothese. Der Phänotyp
der Deletion von PKC1 ist stärker, als der der sac1
∆
slt2
∆
Zellen. Ohne osmotische
Stabilisierung arretieren die pkc1 Nullmutanten als Zellen mit kleiner Knospe und lysieren
(Levin and Bartlett-Heubusch, 1992), während die sac1
∆
slt2
∆
Zellen kurz vor der Zellteilung
arretieren und nach Zugabe von Sorbitol zum Medium wieder wachsen können. Die pkc1
∆
Zellen zeigen einen Zellzyklus spezifischen Arrest, während die sac1 slt2 Zellen einen
Zellwand spezifischen Defekt bei der Trennung der Tochter- von der Mutterzelle nach
vollendeter Cytokinese zeigen. Pkc1p wird parallel zu Bni1p10, das an der Organisation des
Cytoskeletts beteiligt ist, von Rho1p aktiviert, aber die Doppeldeletion von sac1 und bni1
zeigte keinen synthetisch letalen Phänotyp. Diese Ergebnisse lassen die Vermutung zu, daß
Sac1p in einem noch unbekannten Weg aktiv ist, der mit dem Pkc1p Weg verbunden und
parallel dazu, aber nicht parallel zu Bni1p ist.
10 Hefedatenbank: http://quest7.proteom.com/YPD/BNI1.html
Diskussion 72
Abbildung 34: Sac1p agiert parallel zu dem
Pkc1p Weg. Es ist noch nicht bekannt, wie
Sac1p aktiviert wird und an welche Faktoren
Sac1p die Signale weiterleitet.
Eine Parallele zwischen der Regulation von Pkc1p und Sac1p könnte die Aktivierung
und/oder Phosphorylierung durch Cdc28p, das Hefehomolog des Säugetier Cdc2p, sein. Die
Sequenz von Sac1p enthält zwei potentielle Motive11 (Ser514 und Ser611), die allerdings stark
von der Consensussequenz abweichen. Cdc28p ist die essentielle und zentrale Komponente
eines komplexen Mechanismus zur Regulation der einzelnen Schritte im Zellzyklus
(Mendenhall and Hodge, 1998). Eine Phosphorylierung von Sac1p durch Cdc28p ist daher
nicht auszuschließen.
Beide Proteine, Sac1p und Slt2p, sind am polarisierten Zellwachstum beteiligt. Die in
dieser Arbeit dargestellten Daten lassen den Schluß zu, daß Sac1p und Slt2p in verschiedene
Aspekte des polarisierten Zellwachstums involviert sind und eine gemeinsame Funktion in der
Koordination desselben haben. Grundlage für diese Hypothese sind die beschriebenen
gemeinsamen Phänotypen der sac1 und slt2 Mutanten in der Organisation des Aktin
Cytoskeletts, der Lokalisation des Chitins, der reduzierten ATP-Transportrate und die
Ansammlung von Vesikeln im Cytosol der slt2 Mutanten. Außerdem sprechen die
Phänotypen der sac1 slt2 Mutanten für diese Annahme. Diese gemeinsame Funktion von
Sac1p und Slt2p ist nicht ATP-abhängig.
11Datenbank: http://genome-www.stanford.edu/cgi-bin/dbrun/SacchDB?find+Protein_Info+%22SAC1%22
Literatur 73
6 LITERATUR
Adams, A., Gottschling, D. and Stearns, T. (1997) In Methods in yeast genetics. Cold
Spring Harbor Laboratory Press, .
Ausubel, F.M.R.B., Robert E. Kingston, David D. Moore, J. G. Seidman, John A. Smith
and Kevin Struhl (1993) Green Publishing Associates and Wiley-Interscience.
Banuett, F. (1998) Signalling in the yeasts: an informational cascade with links to the
filamentous fungi. Microbiol Mol Biol Rev, 62, 249-74.
Baudin, A., Ozier-Kalogeropoulos, O., Denouel, A., Lacroute, F. and Cullin, C. (1993) A
simple and efficient method for direct gene deletion in Saccharomyces cerevisiae. Nucleic
Acids Res, 21, 3329-30.
Bender, A. and Pringle, J.R. (1991) Use of a screen for synthetic lethal and multicopy
suppressee mutants to identify two new genes involved in morphogenesis in
Saccharomyces cerevisiae. Mol Cell Biol, 11, 1295-305.
Bossemeyer, D., Engh, R.A., Kinzel, V., Ponstingl, H. and Huber, R. (1993)
Phosphotransferase and substrate binding mechanism of the cAMP- dependent protein
kinase catalytic subunit from porcine heart as deduced from the 2.0 A structure of the
complex with Mn2+ adenylyl imidodiphosphate and inhibitor peptide PKI(5-24). Embo J,
12, 849-59.
Buehrer, B.M. and Errede, B. (1997) Coordination of the mating and cell integrity
mitogen-activated protein kinase pathways in Saccharomyces cerevisiae. Mol Cell Biol, 17,
6517-25.
Carman, G.M. and Zeimetz, G.M. (1996) Regulation of phospholipid biosynthesis in the
yeast Saccharomyces cerevisiae. J Biol Chem, 271, 13293-6.
Cherkasova, V., Lyons, D.M. and Elion, E.A. (1999) Fus3p and Kss1p control G1 arrest in
Saccharomyces cerevisiae through a balance of distinct arrest and proliferative functions
that operate in parallel with Far1p. Genetics, 151, 989-1004.
Chuang, J.S. and Schekman, R.W. (1996) Differential trafficking and timed localization of
two chitin synthase proteins, Chs2p and Chs3p [published erratum appears in J Cell Biol
1996 Dec;135(6 Pt 2):1925]. J Cell Biol, 135, 597-610.
Literatur 74
Cid, V.J., Duran, A., del Rey, F., Snyder, M.P., Nombela, C. and Sanchez, M. (1995)
Molecular basis of cell integrity and morphogenesis in Saccharomyces cerevisiae.
Microbiol Rev, 59, 345-86.
Cleves, A.E., Novick, P.J. and Bankaitis, V.A. (1989) Mutations in the SAC1 gene
suppress defects in yeast Golgi and yeast actin function. J. Cell Biol., 109, 2939-2950.
Costigan, C., Gehrung, S. and Snyder, M. (1992) A synthetic lethal screen identifies SLK1,
a novel protein kinase homolog implicated in yeast cell morphogenesis and cell growth.
Mol Cell Biol, 12, 1162-78.
De Camilli, P., Emr, S.D., McPherson, P.S. and Novick, P. (1996) Phosphoinositides as
regulators in membrane traffic. Science, 271, 1533-9.
Doye, V. and Hurt, E.C. (1995) Genetic approaches to nuclear pore structure and function
[published erratum appears in Trends Genet 1995 Jul;11(7):293]. Trends Genet, 11, 235-
41.
Farley, F.W., Satterberg, B., Goldsmith, E.J. and Elion, E.A. (1999) Relative dependence
of different outputs of the Saccharomyces cerevisiae pheromone response pathway on the
MAP kinase Fus3p. Genetics, 151, 1425-44.
Fruman, D.A., Rameh, L.E. and Cantley, L.C. (1999) Phosphoinositide binding domains:
embracing 3-phosphate. Cell, 97, 817-20.
Fujiwara, T., Tanaka, K., Mino, A., Kikyo, M., Takahashi, K., Shimizu, K. and Takai, Y.
(1998) Rho1p-Bni1p-Spa2p interactions: implication in localization of Bni1p at the bud
site and regulation of the actin cytoskeleton in Saccharomyces cerevisiae. Mol Biol Cell, 9,
1221-33.
Garrett-Engele, P., Moilanen, B. and Cyert, M.S. (1995) Calcineurin, the
Ca2+/calmodulin-dependent protein phosphatase, is essential in yeast mutants with cell
integrity defects and in mutants that lack a functional vacuolar H(+)-ATPase. Mol Cell
Biol, 15, 4103-14.
Gietz, R.D. and Sugino, A. (1988) New yeast-Escherichia coli shuttle vectors constructed
with in vitro mutagenized yeast genes lacking six-base pair restriction sites. Gene, 74, 527-
34.
Gray, J.V., Ogas, J.P., Kamada, Y., Stone, M., Levin, D.E. and Herskowitz, I. (1997) A
role for the Pkc1 MAP kinase pathway of Saccharomyces cerevisiae in bud emergence and
identification of a putative upstream regulator. Embo J, 16, 4924-37.
Literatur 75
Guo, S., Stolz, L.E., Lemrow, S.M. and York, J.D. (1999) SAC1-like domains of yeast
SAC1, INP52, and INP53 and of human synaptojanin encode polyphosphoinositide
phosphatases. J Biol Chem, 274, 12990-5.
Gustin, M.C., Albertyn, J., Alexander, M. and Davenport, K. (1998) MAP kinase pathways
in the yeast Saccharomyces cerevisiae. Microbiol Mol Biol Rev, 62, 1264-300.
Hanks, S.K., Quinn, A.M. and Hunter, T. (1988) The protein kinase family: conserved
features and deduced phylogeny of the catalytic domains. Science, 241, 42-52.
Heinisch, J.J., Lorberg, A., Schmitz, H.P. and Jacoby, J.J. (1999) The protein kinase C-
mediated MAP kinase pathway involved in the maintenance of cellular integrity in
Saccharomyces cerevisiae. Mol Microbiol, 32, 671-80.
Helliwell, S.B., Schmidt, A., Ohya, Y. and Hall, M.N. (1998) The Rho1 effector Pkc1, but
not Bni1, mediates signalling from Tor2 to the actin cytoskeleton. Curr Biol, 8, 1211-4.
Hoffman, C.S. and Winston, F. (1987) A ten-minute DNA preparation from yeast
efficiently releases autonomous plasmids for transformation of Escherichia coli. Gene, 57,
267-72.
Holtzman, D.A., Yang, S. and Drubin, D.G. (1993) Synthetic-lethal interactions identify
two novel genes, SLA1 and SLA2, that control membrane cytoskeleton assembly in
Saccharomyces cerevisiae. J Cell Biol, 122, 635-44.
Hong, E., Davidson, A.R. and Kaiser, C.A. (1996) A pathway for targeting soluble
misfolded proteins to the yeast vacuole. J Cell Biol, 135, 623-33.
Hovland, P., Flick, J., Johnston, M. and Sclafani, R.A. (1989) Galactose as gratuitous
inducer of GAL gene expression in yeasts growing on glucose. Gene, 83, 57-64.
Igual, J.C., Johnson, A.L. and Johnston, L.H. (1996) Coordinated regulation of gene
expression by the cell cycle transcription factor Swi4 and the protein kinase C MAP kinase
pathway for yeast cell integrity. Embo J, 15, 5001-13.
Kamada, Y., Jung, U.S., Piotrowski, J. and Levin, D.E. (1995) The protein kinase C-
activated MAP kinase pathway of Saccharomyces cerevisiae mediates a novel aspect of the
heat shock response. Genes Dev, 9, 1559-71.
Kearns, B.G., Alb, J.G., Jr. and Bankaitis, V. (1998) Phosphatidylinositol transfer proteins:
the long and winding road to physiological function. Trends Cell Biol, 8, 276-82.
Literatur 76
Kearns, B.G., McGee, T.P., Mayinger, P., Gedvilaite, A., Phillips, S.E., Kagiwada, S. and
Bankaitis, V.A. (1997) Essential role for diacylglycerol in protein-transport from the yeast
Golgi complex. Nature, 387, 101-105.
Klig, L.S., Homann, M.J., Carman, G.M. and Henry, S.A. (1985) Coordinate regulation of
phospholipid biosynthesis in Saccharomyces cerevisiae: pleiotropically constitutive opi1
mutant. J Bacteriol, 162, 1135-41.
Kochendorfer, K.U., Then, A.R., Kearns, B.G., Bankaitis, V.A. and Mayinger, P. (1999)
Sac1p plays a crucial role in microsomal ATP transport, which is distinct from its function
in Golgi phospholipid metabolism. Embo J, 18, 1506-15.
Kramer, R. and Klingenberg, M. (1977) Reconstitution of adenine nucleotide transport
with purified ADP, ATP- carrier protein. FEBS Lett, 82, 363-7.
Leevers, S.J., Vanhaesebroeck, B. and Waterfield, M.D. (1999) Signalling through
phosphoinositide 3-kinases: the lipids take centre stage. Curr Opin Cell Biol, 11, 219-25.
Levin, D.E. and Bartlett-Heubusch, E. (1992) Mutants in the S. cerevisiae PKC1 gene
display a cell cycle-specific osmotic stability defect. J Cell Biol, 116, 1221-9.
Lorenz, M.C., Muir, R.S., Lim, E., McElver, J., Weber, S.C. and Heitman, J. (1995) Gene
disruption with PCR products in Saccharomyces cerevisiae. Gene, 158, 113-7.
Lyman, S.K. and Schekman, R. (1995) Interaction between BiP and Sec63p is required for
the completion of protein translocation into the ER of Saccharomyces cerevisiae. J Cell
Biol, 131, 1163-71.
Lyman, S.K. and Schekman, R. (1997) Binding of secretory precursor polypeptides to a
translocon subcomplex regulated by BiP. Cell, 88, 85-96.
Ma, H., Kunes, S., Schatz, P.J. and Botstein, D. (1987) Plasmid construction by
homologous recombination in yeast. Gene, 58, 201-16.
Madden, K., Sheu, Y.J., Baetz, K., Andrews, B. and Snyder, M. (1997) SBF cell cycle
regulator as a target of the yeast PKC-MAP kinase pathway. Science, 275, 1781-4.
Majerus, P.W. (1996) Inositols do it all. Genes Dev, 10, 1051-3.
Literatur 77
Martin, H., Arroyo, J., Sanchez, M., Molina, M. and Nombela, C. (1993) Activity of the
yeast MAP kinase homologue Slt2 is critically required for cell integrity at 37 degrees C.
Mol Gen Genet, 241, 177-84.
Martin, T.F. (1998) Phosphoinositide lipids as signaling molecules: common themes for
signal transduction, cytoskeletal regulation, and membrane trafficking. Annu Rev Cell Dev
Biol, 14, 231-64.
Matsuoka, K., Orci, L., Amherdt, M., Bednarek, S.Y., Hamamoto, S., Schekman, R. and
Yeung, T. (1998) COPII-Coated Vesicle Formation Reconstituted with Purified Coat
Proteins and Chemically Defined Liposomes. Cell, 93, 263-275.
Mayinger, P., Bankaitis, V.A. and Meyer, D.I. (1995) Sac1p mediates the adenosine-
triphosphate transport into yeast endoplasmic-reticulum that is required for protein
translocation. J. Cell Biol., 131, 1377-1386.
Mazzoni, C., Zarov, P., Rambourg, A. and Mann, C. (1993) The SLT2 (MPK1) MAP
kinase homolog is involved in polarized cell growth in Saccharomyces cerevisiae. J Cell
Biol, 123, 1821-33.
McPherson, P.S., Garcia, E.P., Slepnev, V.I., David, C., Zhang, X., Grabs, D., Sossin,
W.S., Bauerfeind, R., Nemoto, Y. and De-Camilli, P. (1996) A presynaptic inositol-5-
phosphatase. Nature, 379, 353-357.
Mendenhall, M.D. and Hodge, A.E. (1998) Regulation of Cdc28 cyclin-dependent protein
kinase activity during the cell cycle of the yeast Saccharomyces cerevisiae. Microbiol Mol
Biol Rev, 62, 1191-243.
Newman, A.P., Shim, J. and Ferro-Novick, S. (1990) BET1, BOS1, and SEC22 are
members of a group of interacting yeast genes required for transport fromthe endoplasmic
reticulum to the Golgi complex. Mol. Cell. Biol., 10, 3405 - 3414.
Nothwehr, S.F., Conibear, E. and Stevens, T.H. (1995) Golgi and vacuolar membrane
proteins reach the vacuole in vps1 mutant yeast cells via the plasma membrane. J. Cell
Biol., 129, 35-46.
Novick, P., Field, C. and Schekman, R. (1980) Identification of 23 complementation
groups required for post-translational events in the yeast secretory pathway. Cell, 21, 205-
15.
Novick, P., Osmond, B.C. and Botstein, D. (1989) Suppressors of yeast actin mutations.
Genetics, 121, 659-674.
Literatur 78
O'Rourke, S.M. and Herskowitz, I. (1998) The Hog1 MAPK prevents cross talk between
the HOG and pheromone response MAPK pathways in Saccharomyces cerevisiae. Genes
Dev, 12, 2874-86.
Phillips, S.E., Sha, B., Topalof, L., Xie, Z., Alb, J.G., Klenchin, V.A., Swigart, P.,
Cockcroft, S., Martin, T.F., Luo, M. and Bankaitis, V.A. (1999) Yeast Sec14p deficient in
phosphatidylinositol transfer activity is functional in vivo. Mol Cell, 4, 187-97.
Ram, A.F., Wolters, A., Ten Hoopen, R. and Klis, F.M. (1994) A new approach for
isolating cell wall mutants in Saccharomyces cerevisiae by screening for hypersensitivity
to calcofluor white. Yeast, 10, 1019-30.
Reynolds, T.B., Hopkins, B.D., Lyons, M.R. and Graham, T.R. (1998) The high osmolarity
glycerol response (HOG) MAP kinase pathway controls localization of a yeast golgi
glycosyltransferase. J Cell Biol, 143, 935-46.
Rivas, M.P., Kearns, B.G., Xie, Z., Guo, S., Sekar, M.C., Hosaka, K., Kagiwada, S., York,
J.D. and Bankaitis, V.A. (1999) Pleiotropic Alterations in Lipid Metabolism in Yeast sac1
Mutants: Relationship to "Bypass Sec14p" and Inositol Auxotrophy. Mol Biol Cell, 10,
2235-2250.
Roberts, C.J., Pohlig, G., Rothman, J.H. and Stevens, T.H. (1989) Structure, biosynthesis,
and localization of dipeptidyl aminopeptidase B, an integral membrane glycoprotein of the
yeast vacuole. J Cell Biol, 108, 1363-73.
Rose, M.D., Novick, P., Thomas, J.H., Botstein, D. and Fink, G.R. (1987) A
Saccharomyces cerevisiae genomic plasmid bank based on a centromere- containing
shuttle vector. Gene, 60, 237-43.
Russell, D.W., Jensen, R., Zoller, M.J., Burke, J., Errede, B., Smith, M. and Herskowitz, I.
(1986) Structure of the Saccharomyces cerevisiae HO gene and analysis of its upstream
regulatory region. Mol Cell Biol, 6, 4281-94.
Sambrook, J., Fritsch, E. and Maniatis, T. (1989) In Nolan, C. (eds.), Molecular Cloning:
A laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, , Vol. 1-3.
Schneider, B.L., Seufert, W., Steiner, B., Yang, Q.H. and Futcher, A.B. (1995) Use of
polymerase chain reaction epitope tagging for protein tagging in Saccharomyces
cerevisiae. Yeast, 11, 1265-74.
Literatur 79
Schneider, B.L., Steiner, B., Seufert, W. and Futcher, A.B. (1996) pMPY-ZAP: a reusable
polymerase chain reaction-directed gene disruption cassette for Saccharomyces cerevisiae.
Yeast, 12, 129-34.
Shaw, J.A., Mol, P.C., Bowers, B., Silverman, S.J., Valdivieso, M.H., Duran, A. and
Cabib, E. (1991) The function of chitin synthases 2 and 3 in the Saccharomyces cerevisiae
cell cycle. J Cell Biol, 114, 111-23.
Sikorski, R.S. and Hieter, P. (1989) A system of shuttle vectors and yeast host strains
designed for efficient manipulation of DNA in Saccharomyces cerevisiae. Genetics, 122,
19-27.
Stock, S.D., Hama, H., DeWald, D.B. and Takemoto, J.Y. (1999) SEC14-dependent
secretion in Saccharomyces cerevisiae. Nondependence on sphingolipid synthesis-coupled
diacylglycerol production. J Biol Chem, 274, 12979-83.
Taylor, S.S., Knighton, D.R., Zheng, J., Sowadski, J.M., Gibbs, C.S. and Zoller, M.J.
(1993) A template for the protein kinase family. Trends Biochem Sci, 18, 84-9.
te, H.S. and Aebi, M. (1994) The genetic interaction of kar2 and wbp1 mutations. Distinct
functions of binding protein BiP and N-linked glycosylation in the processing pathway of
secreted proteins in Saccharomyces cerevisiae. Eur J Biochem, 222, 631-7.
Ufano, S., San-Segundo, P., del Rey, F. and Vazquez de Aldana, C.R. (1999) SWM1, a
developmentally regulated gene, is required for spore wall assembly in Saccharomyces
cerevisiae. Mol Cell Biol, 19, 2118-29.
Wang, T. and Bretscher, A. (1995) The rho-GAP encoded by BEM2 regulates cytoskeletal
structure in budding yeast. Mol Biol Cell, 6, 1011-24.
Watanabe, Y., Irie, K. and Matsumoto, K. (1995) Yeast RLM1 encodes a serum response
factor-like protein that may function downstream of the Mpk1 (Slt2) mitogen-activated
protein kinase pathway. Mol Cell Biol, 15, 5740-9.
Whitmarsh, A.J. and Davis, R.J. (1998) Structural organization of MAP-kinase signaling
modules by scaffold proteins in yeast and mammals. Trends Biochem Sci, 23, 481-5.
Whitters, E.A., Cleves, A.E., McGee, T.P., Skinner, H.B. and Bankaitis, V.A. (1993)
SAC1p is an integral membrane protein that influences the cellular requirement for
phospholipid transfer protein function and inositol in yeast. J. Cell Biol., 122, 79-94.
Literatur 80
Wurmser, A.E., Gary, J.D. and Emr, S.D. (1999) Phosphoinositide 3-kinases and their
FYVE domain-containing effectors as regulators of vacuolar/lysosomal membrane
trafficking pathways. J Biol Chem, 274, 9129-32.
Zaret, K.S. and Sherman, F. (1985) alpha-Aminoadipate as a primary nitrogen source for
Saccharomyces cerevisiae mutants. J Bacteriol, 162, 579-83.
Zarzov, P., Mazzoni, C. and Mann, C. (1996) The SLT2(MPK1) MAP kinase is activated
during periods of polarized cell growth in yeast. Embo J, 15, 83-91.
DANKSAGUNG
Herrn Prof. Dr. Dobberstein möchte ich für die Aufnahme in seine Arbeitsgruppe und die
Bereitstellung des Arbeitsplatzes danken.
Mein besonderer Dank gilt Dr. Peter Mayinger, der mich während meiner Doktorarbeit
betreute und immer mit Rat zur Seite stand.
Ferner gilt mein besonderer Dank Yves Cully für die Unterstützung bei den Abbildungen.
Nicht unerwähnt bleiben sollen die anderen Mitarbeiter und vor allem ehemalige
Mitarbeiter der Arbeitsgruppe, bei denen ich mich für ihre stete Hilfsbereitschaft und das
gute Arbeitsklima bedanken möchte.
Meinen Eltern für Ihre jahrelange Unterstützung.
