Christian Gerold Scheuerpflug

Dr. med.

Molekulare und funktionelle Charakterisierung des CD95-SIGNALWEGS bei

peripheren T-Zellen, Tumorzellinien und Patienten mit Leukämien

Geboren am 27.12.1965 in Darmstadt

Reifeprüfung am 19.06.1986 in Seeheim-Jugenheim

Studiengang der Fachrichtung Medizin vom SS 1987 bis SS 1994

Physikum am 05.04.1989 an der Universität Heidelberg

Klinisches Studium an der Ruprecht-Karls-Universität Heidelberg

Promotionsfach: Deutsches Krebsforschungszentrum (DKFZ)

Doktorvater: Herr Prof. Dr. med. Klaus-Michael Debatin

Mit der Entdeckung von Apoptose auslösenden Antikörpern vor 10 Jahren wurde die

Bedeutung des programmierten Zelltodes für den multizellulären Organismus in voller

Tragweite erkannt.

Die Apoptose ist schon in der Embryonalentwicklung für die Differenzierung der

Gewebe sehr wichtig, ebenso im ausgewachsenen Körper für ihre Homöostase. Eine

ganz besondere Rolle spielt sie für das Immunsystem. Bereits heute zeigt sich, wie es zu

schweren Erkrankungen kommt, wenn das streng kontrollierte Apoptose-System

fehlerhaft gesteuert wird. Ein Überhandnehmen der Apoptose kann zu Immundefekten

Leukämien besser zu verstehen. Dazu wurden zuerst normale periphere T-Lympho-zyten

untersucht. Diese sind CD95-resistent und haben den CD95-L auf dem

Transkriptionslevel nur gering exprimiert. Ändert sich der Aktivierungszustand dieser

Zellen, wird der CD95-Rezeptor hoch exprimiert. Unstimulierte periphere

T-Lymphozyten dagegen exprimieren den CD95-Rezeptor auf ihrer Oberfläche nur

gering. Nach Aktivierung mit PHA und IL-2 wird dieser Rezeptor innerhalb von

Stunden hochreguliert, ohne daß die peripheren T-Lymphozyten Apoptose-sensitiv

werden. Erst nach vier Tagen mit IL-2-Stimulierung werden die Zellen CD95-sensitiv,

das CD95-Antigenmuster auf der Oberfläche verändert sich dabei nicht. Es konnte nun

nachgewiesen werden, daß sich Caspase-8 bei den resistenten peripheren T-Lympho-

zyten nicht an den DISC bindet. Dagegen findet man diese Protease bei den sensitiven

peripheren T-Lymphozyten im DISC, und dieser aktiviert dann die Apoptose. Der

Mechanismus der Caspase-Assoziation an den DISC ist noch unbekannt. Durch Verhin-

derung der Caspase-8-Bindung kann jedoch der Apoptose-Typ-1 blockiert werden.

Gleichzeitig wurde eine Korrelation des Apoptose hemmenden Proteins Bcl-xL mit dem

Sensitivitätsverhalten von peripheren T-Lymphozyten gefunden. In unstimulierten

peripheren T-Lymphozyten blockiert sind, kommt es zur vollständigen Resistenz.

Anschließend wurde untersucht, wie sich das CD95-System in T- und B-Leukämie-

Zellinien verhält. Dazu wurden CD95-sensitive mit CD95-resistenten Leukämie-Zellinien

verglichen. Es zeigte sich, daß CD95-sensitive Zellinien im Durchschnitt eine höhere

CD95-Expression auf ihrer Zelloberfläche aufweisen. Darüber hinaus war der CD95-L

konstitutiv nur auf CD95-sensitiven Leukämie-Zellinien nachzuweisen. Nach Stimulation

konnten aber alle Leukämie-Zellinien den CD95-L stark hochregulieren. Verglichen mit

B-Leukämie-Zellinien waren T-Leukämie-Zellinien in der Lage, den CD95-L um mehr

als das 10-fache hochzuregulieren. Die anderen untersuchten Schlüsselmoleküle zeigten

keine Korrelation mit der CD95-Sensitivität. Interessanter-weise wurde Bcl-xL bei allen

(bax, bik, bcl-2, bcl-xL) und die Caspasen (ice, ich-1, cpp32) zeigten keine

Veränderung. Das bedeutet, daß die für den programmierten Zelltod nötigen Proteine

bereits in der Zelle vorliegen und nicht erst hergestellt werden müssen. Dafür spricht

auch der rasche Beginn der Apoptose etwa 30 min nach der Stimulation mit

Die Untersuchungen erstreckten sich dann weiter auf Leukämiezellen von Patienten, die

noch keine Therapie erhalten hatten. Dabei zeigte sich zuerst, daß alle Tumorzellen

CD95-resistent waren, und auf der Oberfläche fanden sich unterschiedlich viele

CD95-Rezeptoren. Die Menge von CD95 und die Resistenzstärke ließen sich nicht

korrelieren. Auf der Transkriptionsebene ergab sich, daß diese Zellen den CD95-L nur

gering exprimieren, dafür wurde eine Spleißform des CD95-Rezeptors (sCD95)

vermehrt gebildet. Dieses lösliche Protein konnte in großer Menge im Pleuraexudat eines

daß das CD95-L-Gen keinen großen Polymorphismus aufweist. In Leukämie-Zellinien

und im Probenmaterial von Patienten mit Morbus Hodgkin fanden sich keine Mutationen

im Bereich von Exon4 des CD95-L.

Die Ergebnisse dieser Arbeit können für die Diagnostik und Therapie von Leukämien

eine weitreichende Bedeutung erlangen. Zum einen konnte gezeigt werden, daß die

histologische und phänotypische Charakterisierung von Leukämiezellen noch nicht aus-

reicht, um diese Tumorzellen zu definieren. Der tumorauslösende Defekt muß

molekular, das heißt auf der DNA-Ebene gesucht werden. Zum zweiten ergibt sich aus

dem genauen Verständnis des CD95-Signalwegs die Möglichkeit, gentherapeutisch ein-

zugreifen. Dadurch können entweder Defekte ganz spezifisch repariert oder Fehler-