Marie-Charlotte von Brevern
Dr. sc. hum.
Inaktiverung von Tumorsuppressorgenen bei der Entstehung von Speiseröhrenkrebs:
Neue Mechanismen, Genorte und klinische Anwendungsmöglichkeiten
Geboren am 24.04.1969 in Speyer
Reifeprüfung am 21.06.1988
Studiengang der Fachrichtung Biologie (Diplom) vom WS 1988/89 bis WS 1994/95
Vordiplom am 15.03.1991 an der Universität Würzburg
Diplom am 31.01.1995 an der Universität Würzburg
Promotionsfach: Deutsches Krebsforschungszentrum (DKFZ)
Doktorvater: Prof. Dr. rer. nat. H. Bartsch
Zusammenfassung:
Die Inaktivierung von Tumorsuppressorgenen wurde als ein wichtiger Schritt bei
der Entstehung von Krebszellen erkannt. Die Aufklärung der daran beteiligten
Prozesse sowie die Identifizierung von betroffenen Tumorsuppressorgenen stellt
damit eine der Voraussetzungen für die Entwicklung von
Krebspräventionsstrategien und gezielten Therapiemaßnahmen dar.
Eines der am häufigsten mutierten Gene in Humantumoren ist das p53
Tumorsuppressorgen. Seine Funktion als "Wächter des Genoms" hat es in den
Mittelpunkt von klinischer und Grundlagenforschung gerückt, wobei als wichtiger
Aspekt die Rolle von p53 als diagnostischer und prognostischer Marker zu klären
ist.
In der vorliegenden Doktorarbeit wurden Speiseröhrenkrebspatienten (N=65) aus
zwei Hochrisikoregionen in Frankreich und China daraufhin untersucht, ob sie
Serumantikörper gegen mutiertes p53 aufweisen, und inwieweit sich deren Nachweis
für die Früherkennung von Speiseröhrenkrebs eignet. Immunhistochemische,
Mutations- und serologische Analysen hinsichtlich des p53 Status der Tumoren der
Patienten wurden mit der anti-p53 Immunreaktion verglichen. In 25% der Patienten
konnten anti-p53 Autoantikörper nachgewiesen und eine signifikante Korrelation
zwischen der anti-p53 Seropositivität und tumorspezifischen p53 Genmutationen
etabliert werden (P < 0,01). Dabei scheinen Mutationen, die zu einer
strukturellen Veränderung von p53 führen, und weniger die Anreicherung des p53
Proteins per se für die Produktion von p53 Antikörpern in
Speiseröhrenkrebspatienten verantwortlich zu sein. Insgesamt scheinen
Wirtsfaktoren bei der Auslösung einer anti-p53 Immunreaktion zu überwiegen.
P53 Mutationsanalysen in Tumoren der Patienten aus Guangzhou wurden im Rahmen
einer epidemiologischen Pilotstudie ausgewertet, wobei Mutationsfrequenz und –
muster mit Expositionsdaten verglichen wurden. Neben bekannten Risikofaktoren
für Ösophaguskrebs wie Zigarettenkonsum wies die relativ hohe Mutationsfrequenz
bei Nichtrauchern darauf hin, daß auch ernährungsbedingte Karzinogene wichtige
Risikofaktoren für Speiseröhrenkrebs in der chinesischen Provinz Guangzhou
darstellen. Eine früher in Patienten aus Guangzhou beschriebene Hotspotmutation
im Kodon 176 konnte in dieser Arbeit nicht bestätigt werden.
Um aufzuklären, ob neben p53 auch andere Tumorsuppressorgene bei der Auslösung
von sporadischem Speiseröhrenkrebs eine Rolle spielen, wurde in dem zweiten Teil
der Arbeit das Tylose Ösophaguskrebsgen (TOCG) untersucht. Dieses Gen führt bei
Trägern der seltenen Erbkrankheit Tylose zur Entwicklung von Speiseröhrenkrebs.
Der häufig gefundene Allelverlust in der chromosomalen Region des TOC Gens in
fast 70% der untersuchten sporadischen Speiseröhrenkarzinome (N=35) verstärkt
den Verdacht, daß dieses Gen auch bei der Auslösung von nicht-familiären
Speiseröhrentumoren eine Rolle spielt.
Im dritten Teil dieser Arbeit wurde die Frage untersucht, ob die
Retrotransposition normaler zellulärer Sequenzen in humanen Zellen in einem
meßbaren Ausmaß stattfindet. Damit sollte die Hypothese getestet werden, ob
dieser Prozeß in Form von insertioneller Mutagenese in der Karzinogenese von
Relevanz sein könnte. Verschiedene in vitro Reportersysteme wurden durch stabile
Transfektion humaner Zellinien mit Reporterplasmiden etabliert, mit denen zum
einen die Retrotranspositionsfrequenz normaler zellulärer Sequenzen, und zum
anderen die Aktivierbarkeit des Promotors eines aktiven LINE-1 Retrotransposons
untersucht wurden. Erste Ergebnisse der in vitro Retrotranspositions-
Reportersysteme bestätigten, daß solche Ereignisse tatsächlich in HeLa-Zellen
und wie erstmals nachgewiesen auch in MCF-7 Zellen stattfinden. Die Häufigkeit,
mit der solche Ereignisse stattfanden, war bei den einzelnen Zellklonen deutlich
verschieden, obwohl in allen eine stabile Expression der Retrotranspositions-
Reporterkassette nachgewiesen werden konnte. Die Behandlung eines HeLa Zellklons
(HJ #4-5) mit dem demethylierenden Agens Azacytidin oder durch längere
stationäre Wachstumsbedingungen führten zu keiner meßbaren Steigerung der
Retrotranspositionsereignisse. Um die Expression des stabil integrierten
Reporterkonstruktes bzw. von endogenen LINE-Elementen, welche vermutlich die
Retrotransposition beeinflussen, in den behandelten Zellen zu analysieren, wurde
eine Multiplex RT-PCR entwickelt. Diese lieferte erste Hinweise auf einen
Anstieg der Reporterkassetten-mRNA nach Azacytidin-Behandlung und nach längerem
stationären Wachstum. Mit dem zweiten etablierten Reportersystem für die
Aktivierbarkeit des humanen LINE-1.2 Promotors in HeLa-Zellen wurde eine
schnelle und einfache, zusätzliche Methode entwickelt, mit der sich der Einfluß
verschiedener Faktoren auf die Expression von LINE-Retrotransposons testen läßt.
LINE-Promotor aktivierende Faktoren können dann in den etablierten
Retrotranspositions-Reportersystemen auf ihre Bedeutung für die
Retrotranspositionsfrequenz normaler zellulärer Gene untersucht werden.
