Jörg Heinrich Schimpf
Dr. med.
Altern und alternsabhängige Veränderungen polyanionischer Strukturen bei der Nema-
tode Caenorhabditis elegans
Geboren am 23.01.1963 in Jugenheim
Reifeprüfung am 26.05.1982 in Seeheim an der Bergstraße
Studiengang der Fachrichtung Medizin vom SS 1985 bis WS 1994
Physikum am 27.03.1987 an der Universität Heidelberg
Klinisches Studium in Heidelberg
Praktisches Jahr in Bruchsal
Staatexamen am 25.05.1994 an der Universität Heidelberg
Promotionsfach: Anatomie
Doktorvater: Professor Dr. med. Klaus Sames
Caenorhabditis elegans ist als sehr gutes Modell für Alternsstudien aufgrund seines kurzen
Lebens, seiner einfachen Anatomie, seiner begrenzten Anzahl ausschließlich postmitotischer
Zellen und seines völlig entschlüsselten zellulären Genoms bekannt. Ergebnisse bezüglich
Proteoglykanen sind rar. Weil diese Substanzen im allgemeinen deutlichere alternsabhängige
Unterschiede aufweisen als andere molekulare Systeme, sind diese Veränderungen auf einem
niedrigen evolutionären Niveau bei postmitotischen Zellen ohne Überlagerung intermitoti-
scher Klone für die Gerontologie von außerordentlichem Interesse. Die verwendeten Metho-
den erlauben es nicht, Proteoglykane mit letzter Sicherheit zu unterscheiden, sind aber sehr
gute Screeningmethoden und durchaus in der Lage Glykosaminoglykane aufzufinden. Es gibt
jedoch Färbungen, die sich nicht einordnen lassen. Deshalb nennen wir unsere Substrate „Po-
lyanionische Substanzen“.
Caenorhabditis elegans wurde auf Agar-Plattten kultiviert und unter monoxenischen Bedin-
gungen mit E. coli-Bakterien ernährt. Die Kulturen wurden durch Freisetzung der Eier ge-
startet, die Würmer mittels einer temperatursensitiven Mutante (DH 26) alterssynchron aufge-
züchtet und nach 60 Stunden (jung), 144 Stunden (mittel) und 228 Stunden (alt) abgeerntet.
Die Würmer wurden in einer modifizierten Fixationslösung nach Ito für die Elektronenmikro-
skopie fixiert. Bevor sie mit der CEC-Methode mit verschiedenen MgCl2-Konzentration in
Cuprolinic-Blue gefärbt wurden, wurden sie in der Körpermitte mittels einer Glaskörperschere
quer durchtrennt. Aus jeder Altersgruppe wurde ein Teil der Tiere in Chondroitinase AC,
Chondroitinase ABC, Hyaluronidase und Heparitinase inkubiert und schließlich eine Kon-
trollgruppe, ohne die vorhergehende Behandlung, mit Osmiumtetroxyd kontrastiert. Einge-
bettet wurden die Präparate in Epon 812. Die Ultradünnschnitte wurden zunächst ohne zu-
sätzlichen Kontrast analysiert, ein Teil davon mittels Bleicitrat nachkontrastiert und nochmals
analysiert.
Die am konstantesten gefärbten Strukturen zeigen sich in der Kutikula, im Bürstensaum des
Intestinums und den Gonaden. Aufgrund der vorliegenden Befunde ist davon auszugehen, daß
bei Caenorhabditis elegans Glykosaminoglykane bzw. Proteoglykane vorkommen.
Im einzelnen konnten Chondroitinsulfate in der externen Epikutikula, Chondroitinsulfate und
Dermatansulfat in der Mesokutikula und den Mikrovilli der Intestinalzellen und
Heparansulfat im „terminal web“ nachgewiesen werden. Nicht definitiv charakterisierbare
Glykosaminoglykane mit hochspezifischer polyanionischer Anfärbbarkeit stellen sich in den
Eizellen dar. Die Wirkung der Chondroitinasen in der externen Epikutikula nimmt mit zu-
nehmendem Alter ab, in der Mesokutikula zu. Die altersabhängigen Unterschiede sind mögli-
cherweise durch eine veränderte Eluierbarkeit erklärbar, wobei in der Epikutikula die ältere, in
der Mesokutikula eher die jüngere Matrix leichter eluierbar ist. Im „terminal web“ ist He-
paransulfat altersabhängig vermindert. In der Mesokutikula zeigen sich altersabhängig de-
struktive Veränderungen, die wahrscheinlich Glykosaminoglykane einbeziehen. Das Ausmaß
der Destruktion von Zellen intermitotischer Zellklone nimmt mit zunehmendem Alter zu. Die
Gonadenzellen als einziger intermitotischer Zellklon ist einem signifikant geringeren De-
struktionsprozess ausgesetzt.
Die in der Literatur beschriebenen Sitze von Polyanionen werden bestätigt. Die Ergebnisse bei
Anwendung der CEC-Methode weisen auf das Vorkommen von Glykosaminoglykanen hin,
was durch spezifische Glykosidasen erhärtet wird. Ob die Glykosaminoglykane in Proteogly-
kanen vorliegen, ist mit den hier verwendeten Methoden nicht überprüfbar. Die altersabhängi-
gen Befunde im „terminal web“ können auf eine altersabhängige strukturelle Veränderung
von Heparansulfat mit Resistenz gegen Heparitinase zurückzuführen sein. Bei dem in den
Gonaden vorkommenden Polyanion, welches ebenso wie die Substanz im Bürstensaum alter
Intestinalzellen auf keines der Enzyme reagiert, könnte es sich um das nach der Literatur bei
Protostomata nicht vorkommende Keratansulfat handeln. Besonders interessant sind die al-
tersabhängigen Veränderungen der Glykosaminoglykane der Darmepithelzellen, da beim
Menschen der schnelle Ersatz der Zellen solche Beobachtungen verhindert. Alternde postmi-
totische Zellverbände sind offensichtlich in der Lage sehr lange eine hohe Konstanz der Lo-
kalisation und Mengenverhältnisse von Glykosaminoglykanen zu erhalten. Strukturverände-
rungen im Sinne einer im Alter sich beschleunigenden Destruktion von Zellorganellen und
Veränderung des Zytoplasmas sind zu beobachten aber nicht mit Veränderungen der polya-
nionischen Strukturen in Verbindung zu bringen. Ein interessanter Nebenbefund sind Hinwei-
se auf stark hydratisierte Glykosaminoglykane vom Chondroitinsulfat-Dermatansulfat-Typ,
die der Mesokutikula prall elastische Eigenschaften (Formstabilität bei hoher Beweglichkeit)
verleihen könnten.
