JürgenRitter
Dr. med.
Bindung von IGF-I an kultivierte humane Endothelzellen und ihre extrazelluläre Matrix
Geboren am 12. 04. 1968 in Gießen, Hessen
Reifeprüfung am 09. 06. 1987 in Gießen, Hessen
Studium der Fachrichtung Medizin vom SS 1989 bis SS 1996
Physikum am 19. 03. 1991 an der Universität Heidelberg
Klinisches Studium in Heidelberg
Praktisches Jahr in Heidelberg
Staatsexamen am 07. 05. 1996 an der Universität Heidelberg
Promotionsfach: Kinderheilkunde
Doktorvater: Herr Prof. Dr. med. U. Heinrich
In der vorliegenden Arbeit wurde die Rolle des Gefäßendothels als selektive Barriere für IGF-
I untersucht. Als Modell dienten kultivierte humane Endothelzellen aus Nabelschnurvenen
(HUVEC). Diese Zellen bilden in vitro einen Monolayer und synthetisieren eine
extrazelluläre Matrix, die den in vivo Bedingungen vergleichbar ist.
Zunächst wurde die Bindung von 125J-IGF-I an die Zelloberfläche und separat an die sub-
endotheliale Matrix charakterisiert. Es konnte die spezifische Bindung von 125J-IGF-I an
HUVEC Monolayer demonstriert werden. Die Bindung war zeit- und konzentrationsabhängig.
Bei 22°C erreichte die 125J-IGF-I-Bindung nach 4 Stunden ein Plateau, das über mehrere
Stunden konstant blieb. Im Unterschied dazu wurde bei 37°C ein Maximum der Bindung
bereits nach 2 Stunden erreicht und nahm anschließend wieder ab. Durch weitere Versuche
konnte gezeigt werden, daß 125J-IGF-I bei 22°C nur marginal, bei 37°C zum überwiegenden
Teil internalisiert wird. Die Bindungskapazität für die 125J-IGF-I-Bindung an HUVEC war
bei 22°C und bei 37°C gleich und betrug 2-2,5 fmol/35mm Kulturschale. Somit ließ sich der
Prozeß der Internalisierung durch Beeinflussung der Inkubationstemperatur steuern. Heparin
und andere Glykosaminoglykane beeinflussen die Bindung von IGF-Bindungsproteinen (IGF-
BP) an Zelloberflächen. Daher wurde der Einfluß von Heparin auf die IGF-I-Bindung an
HUVEC und als Vergleich an kultivierte humane Fibroblasten (HFB) untersucht. Die IGF-I-
Bindung an HUVEC ließ sich nicht durch Heparin beeinflussen. Im Unterschied dazu wurde
die Bindung von 125J-IGF-I an HFB durch Heparin reduziert und Heparin führte zu einer
Freisetzung von IGF-BP-3 in den Fibroblastenkulturen. Dies deutet indirekt darauf hin, daß
die IGF-I-Bindung an HUVEC nicht durch IGF-Bindungsproteine vermittelt wird.
Zur Matrixgewinnung wurden die Zellen nichtenzymatisch durch Triton-X 100 (1% v/v) und
NH3 (20 mM) entfernt. Anschließend wurden Bindungsstudien mit 125J-IGF-I in Analogie zu
den Experimenten an HUVEC Monolayern durchgeführt. In dieser Arbeit wird erstmals eine
spezifische Bindung von IGF-I an die extrazelluläre Matrix von Endothelzellen beschrieben.
Die Bindung war zeit- und konzentrationsabhängig. Zur weiteren Charakterisierung der
IGF-I-Bindung an die extrazelluläre Matrix wurde zunächst der Einfluß von Proteasen
untersucht. Wurde die extrazelluläre Matrix vor den Bindungsversuchen mit Proteasen
(Trypsin, Collagenase, Dispase, Plasmin) inkubiert, war die spezifische Bindung von 125J-
IGF-I deutlich reduziert oder sogar komplett verlorengegangen. Dies deutet darauf hin, daß
Proteinbestandteile der extrazellulären Matrix für die IGF-I-Bindung erforderlich sind. Die
extrazelluläre Matrix ist reich an Glykosaminoglykanen. Um die Rolle dieser Substanzgruppe
bei der IGF-I-Bindung an die Matrix zu untersuchen, wurden Bindungsstudien in
Anwesenheit von Überschußanteilen verschiedener Glykosaminoglykane durchgeführt. Chon-
droitin-Sulfat, Dermatan-Sulfat und verschiedene Heparinfraktionen hatten allesamt keinen
Einfluß auf die IGF-I-Bindung an die Matrix von HUVEC. Die Bindung wurde aber durch ein
Milieu hoher Ionenstärke partiell inhibiert. Mittels spezifischer Antikörper gegen
Matrixproteine wurde versucht, die an der Bindung beteiligten Proteine der Matrix zu charak-
terisieren. Antikörper gegen Collagen Typ I und Typ IV, gegen Fibronektin, Laminin und von
Willebrand Faktor hatten keinen Einfluß auf die Bindung von 125J-IGF-I an die
subendotheliale Matrix. Anti Vitronektin Antikörper hemmen die spezifische Bindung von
125J-IGF-I an die extrazelluläre Matrix konzentrationsabhängig um bis zu 30%. Dies deutet
auf eine Rolle von Vitronektin bei der Matrixbindung von IGF-I hin.
Zur Untersuchung der Frage, ob IGF-I aktiv durch das Endothel transportiert und in der extra-
zellulären Matrix deponiert wird, wurden HUVEC Monolayer bei 22°C und 37°C parallel mit
125J-IGF-I inkubiert. Anschließend wurde die zelluläre Fraktion und die Matrixfraktion
separat analysiert. Bei Raumtemperatur gelangte lediglich 5% des gebundenen 125J-IGF-I in
die subendotheliale Matrix. Wurden die Versuche jedoch bei 37°C durchgeführt, kam es zu
einem zeitabhängigen Anstieg von gebundenen 125J-IGF-I in der extrazellulären Matrix, der
nach 8 Stunden 50% des spezifisch gebundenen 125J-IGF-I ausmachte. Die Zunahme der
Matrixbindung verlief konkordant mit der Abnahme des zellgebundenen Anteils von IGF-I.
Somit ist das Gefäßendothel aktiv an dem Transport von IGF-I aus dem Gefäßlumen in den
Extravasalraum beteiligt.
