Simon Heuthe
Dr. med.
Die Effekte von Dihydrotestosteron und Wachstumsfaktoren auf menschliche
Knochenzellen in vitro
Geboren am 1.3.1965 in Öhringen
Reifeprüfung am 2.6.1984 in Öhringen
Studiengang der Fachrichtung Medizin vom SS 1987 bis WS 1995
Physikum am 5.4.1989 an der Universität Heidelberg
Klinisches Studium in Heidelberg
Praktisches Jahr in Bad Mergentheim und Wil (Schweiz)
Staatsexamen am 9.5.1995 an der Universität Heidelberg
Promotionsfach: Innere Medizin
Doktorvater: Prof. Dr. med. R. Ziegler
Der kontinuierliche Knochenumbau am menschlichen Skelett wird durch systemische und lokale
Regulatoren des Knochenzellstoffwechsels gesteuert. Eine bedeutende Rolle spielen hierbei
androgene Steroide und Wachstumsfaktoren. Dies ist durch zahlreiche Beobachtungen und
Untersuchungen am Menschen und in Tiermodellen, sowie durch Ergebnisse aus zellbiologi-
schen Experimenten in menschlichen und tierischen Knochenzellmodellen belegt. Der durch
eine insuffiziente Gonadenfunktion hervorgerufene Androgenmangelzustand ist mit einer
verminderten Knochendichte und einem erhöhten Risiko hinsichtlich der Entwicklung einer
Osteoporose assoziiert. Bei Zuständen sowohl exogener als auch endogener Steigerung der für
den Organismus verfügbaren Androgenspiegel wird die Osteogenese und der Knochen-
stoffwechsel stimuliert. Bei kastrierten männlichen und weiblichen Ratten kann durch die Gabe
von Androgenen die Entwicklung einer konsekutiven Osteopenie vermieden werden. Neben der
Entdeckung und Quantifizierung von Androgenrezeptoren auf menschlichen und murinen osteo-
blastären Zellen, konnte eine direkte Stimulation der osteoblastären Proliferation und
Differenzierung durch Dihydrotestosteron in vitro nachgewiesen werden. Die Wachstumsfak-
toren Insulin-like Growth Factor (IGF)-I und -II, Transforming Growth Factor (TGF)-β und
Fibroblast Growth Factor (FGF) sind regulatorische Polypeptide, die von Osteoblasten produ-
ziert, sezerniert und in der Knochenmatrix gespeichert werden. Wie viele andere Zelltypen
besitzen osteoblastäre Zellen spezifische Bindungsstellen für die genannten Wachstumsfaktoren.
Zahlreiche in vivo-Studien belegen, daß IGF, TGFβ und FGF an der Stimulation der
Osteogenese und dem Erhalt der Knochenmasse beteiligt sind. Bei Osteoblasten in vitro ist ein
steuernder Einfluß der Wachstumsfaktoren bei der Mitose und auch bei verschiedenen differen-
zierten Zellfunktionen nachweisbar. Der Androgenwirkmechanismus im Knochenstoffwechsel
ist nicht genau bekannt. Für eine Vermittlung der Androgenwirkung durch Wachstumsfaktoren
sprechen Befunde, nach denen Dihydrotestosteron (DHT) bei Osteoblasten die Expression von
TGFβ stimuliert und den mitogenen Effekt von IGF2 und FGF verstärkt. Werden in klinischen
und experimentellen Studien die Merkmale "Geschlecht" und "Alter" berücksichtigt, ergeben
sich im Knochengewebe ganz unterschiedliche Androgeneffekte. Andere Untersuchungen
enthalten direkte Hinweise auf geschlechts- und altersabhängige Androgenwirkungen. Wir
stellten deshalb die Hypothese auf, daß DHT in normalen menschlichen Knochenzell-
populationen, die sich durch Geschlecht und Altersgruppe unterscheiden, differentielle Wirkun-
gen entfaltet. Unter Berücksichtigung der Interaktionen von Androgenen mit Wachstumsfakto-
ren, stellte sich außerdem die Frage, ob die Wirkungen von IGF, FGF und TGFβ in normalen
menschlichen Knochenzellpopulationen geschlechts- und altersgruppenspezifische Unterschiede
zeigen. Zur Klärung der sich daraus ergebenden Fragen, dienten aus menschlicher Knochen-
spongiosa durch Präparation, Primärkultur und Subkultivierung gewonnene präpubertär männ-
liche, präpubertär weibliche, adult männliche und adult weibliche osteoblastäre Zellpopulatio-
nen, in denen nach ihrer vergleichenden Charakterisierung spezifische Effekte von DHT und
IGF, FGF und TGFβ unter standardisierten und kontrollierten Bedingungen untersucht wurden.
Die Charakterisierung der Knochenzellpopulationen erfolgte durch die quantitative Bestimmung
der Expression anerkannter osteoblasten-spezifischer Merkmale (Bestimmung des Prozentsatzes
alkalische Phoshatase (AP)-positiver Zellen nach histochemischer Lokalisation der AP,
Messung der Osteokalzinsekretion mittels Radioimmunoassay). Ähnlich wie die AP ist
Osteokalzin (OC) ein bei der Knochenneubildung synthetisiertes nichtkollagenenes Protein. Zur
Beurteilung der Effekte einer DHT- und Wachstumsfaktorbehandlung untersuchten wir in den
entsprechenden Zellpopulationen die DNA-Synthese als Parameter der Zellproliferation und die
spezifische alkalische Phosphatase-Aktivität als Parameter der Zelldifferenzierung. Die
Verwendung von transformierten Knochenzellinien und neonatalen murinen Knochenzellen als
Modell für menschliche Osteoblasten ist wegen ihres unvollständigen osteoblastären Phänotyps
bzw. alters- und speziesbedingter Unterschiede problematisch. Die im Vergleich zu transfor-
mierten Knochenzellen begrenzte Zellausbeute und evtl. Instabilität des osteoblastären Phäno-
typs bei normalen menschlichen Osteoblasten werden in Kauf genommen zugunsten der
Möglichkeit, auf zellulärer Ebene direkte Auswirkungen von Substanzen auf normale Zell-
funktionen humaner Osteoblasten untersuchen zu können. Die Experimente wurden so
konzipiert, daß die Heterogenität von normalen menschlichen Knochenzellen hinsichtlich des
osteoblastären Phänotyps und nichtosteoblastärer Zellelemente nicht zu Ergebnisverfälschungen
führen konnte. Die Charakterisierung zeigte, daß bei den weiblichen Zellpopulationen der
Prozentsatz AP-positiver Zellen signifikant größer war als bei den männlichen Zellpopulationen.
Dieser bei präpubertären und adulten Zellen vorhandene Geschlechtsunterschied ist mögli-
cherweise genetisch determiniert. Denkbar wäre auch eine bei weiblichen Osteoblasten primär
stärkere Expression autokrin aktiver Faktoren, die aufgrund ihrer differenzierenden
Eigenschaften dann sekundär zu einer stärkeren Expression der AP führen könnten. Sowohl in
den präpubertär männlichen als auch in den adult männlichen Zellpopulationen war eine
signifikant höhere OC-Produktion nachweisbar als in den entsprechenden weiblichen Zellpopu-
lationen. Ähnliche Geschlechtsunterschiede sind bei den OC-Serumspiegeln und bei den im
Knochen gespeicherten OC-Mengen bekannt. Analog zur AP könnte es sich um einen
altersunabhängigen primär genetisch verankerten geschlechtsspezifischen Unterschied der OC-
Expression handeln. Denkbar wäre auch eine geschlechtsabhängige Expression von Regula-
tionsfaktoren der osteoblastären OC-Synthese. DHT stimulierte die DNA-Synthese von adulten
und präpubertär männlichen Osteoblasten, nicht jedoch von präpubertär weiblichen Osteo-
blasten. Der beobachtete Geschlechtsunterschied des Androgeneffektes auf die DNA-Synthese
von menschlichen präpubertären Knochenzellen korrespondiert zu geschlechtsabhängigen Be-
funden im Rattenmodell. Eine mögliche Erklärung für die erst nach der Pubertät bei weiblichen
Osteoblasten beobachtete mitogene Reaktion auf DHT, die bei den adult weiblichen Osteobla-
sten signifikant größer war als bei den adult männlichen Zellen, wäre eine Induktion der Andro-
genrezeptorexpression durch ansteigende Östrogenspiegel während der Pubertät. DHT stimu-
lierte die Differenzierung in weiblichen Osteoblasten stärker als in männlichen Osteoblasten.
Damit ergibt sich folgender Zusammenhang: Unabhängig von der Altersgruppe zeigten weibli-
che Osteoblasten eine höhere basale AP-Expression als männliche Osteoblasten und reagierten
auf eine DHT-Exposition mit einer signifikant stärkeren Stimulation der AP-Expression als
männliche Zellen. Möglicherweise wird somit in osteoblastären Zellen mit einem hohen basalen
AP-Gehalt durch eine DHT-Behandlung eine stärkere Stimulation der AP-Expression bewirkt
als in Osteoblasten mit einer niedrigen basalen AP-Expression. Auch bei weiblichen
osteoblastären Zellen führt die Applikation von DHT bei Subpopulationen mit hoher basaler
AP-Aktivität zu einer stärkeren Stimulation der AP-Expression als bei Subpopulationen mit
niedriger basaler AP-Aktivität. Daher könnte es sich bei der in weiblichen Osteoblasten stärker
ausgeprägten Stimulation der Differenzierung durch Androgene nicht um einen primär ge-
schlechtsspezifischen Unterschied handeln, sondern um eine variable Androgenwirkung in
Abhängigkeit von der basalen AP-Aktivität. Mitogene Wachstumsfaktoren stimulierten die
DNA-Synthese von präpubertären Osteoblasten stärker als von adulten Osteoblasten. Für diesen
Altersunterschied sind möglicherweise höhere Rezeptorzahlen im Kindesalter verantwortlich,
die durch eine gesteigerte Aktivität von osteotropen Hormonen im Zuge des beschleunigten
Knochenwachstums induziert werden. Der beobachtete mitogene Reaktionsunterschied zwi-
schen der präpubertären und der adulten Altersgruppe könnte auch Ausdruck sein einer alters-
bedingten generellen Abnahme der ostoblastären Fähigkeit auf mitogene Stimuli zu reagieren.
Wachstumsfaktoren mit stimulierender Wirkung auf die Differenzierung bei männlichen
Osteoblasten hatten nur einen marginalen differenzierenden Effekt bei weiblichen Osteoblasten.
Damit ergibt sich ein weiterer Zusammenhang: Unabhängig von der Altersgruppe zeigten
männliche Osteoblasten eine niedrigere basale AP-Expression als weibliche Osteoblasten und -
reagierten auf eine TGFβ- bzw. IGF2-Behandlung mit einer starken Stimulation der AP-
Expression, während weibliche Zellen kaum reagierten. Möglicherweise kann eine signifikante
Stimulation der AP-Aktivität nur in denjenigen Knochenzellpopulationen erzielt werden, die
eine niedrige basale AP-Expression aufweisen. Auch in weiblichen osteoblastären Subpopulatio-
nen mit differierender basaler AP-Expression zeigt die Stimulation der AP-Aktivität durch IGF2
Unterschiede. Deshalb könnte der bei männlichen Osteoblasten stärker ausgeprägten Stimulation
der AP-Aktivität kein primärer Geschlechtsunterschied zugrunde liegen, sondern eine variieren-
de Wachstumsfaktorwirkung in Abhängigkeit von der basalen AP-Expression der Knochenzel-
len. Warum die AP-Aktivität von TGFβ und IGF2 nur in Knochenzellpopulationen mit niedriger
basaler AP-Expression (männliche Osteoblasten) stimuliert wird und von DHT dagegen nur in
Zellpopulationen mit hoher basaler AP-Expression (weibliche Osteoblasten), ist nicht bekannt
und mit den Ergebnissen dieser Untersuchungen nicht zu erklären. Diese Frage wird sich eher
beantworten lassen, wenn die Ursache für die unterschiedliche basale AP-Expression von männ-
lichen und weiblichen osteoblastären Zellen geklärt ist.
